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背景:食管癌的死因顺位位居全球第六,发病率居全球第八位,占我国恶性肿瘤发病第四位,是临床常见的恶性肿瘤。LncRNA,已成为癌症中的关键调节因子。LincRNA-p21是p53基因下游的转录本,研究表明,LincRNA-p21异常表达在多种肿瘤的发生发展中发挥着重要作用,但其在食管癌中的作用机制仍披着一层神秘的面纱。本研究拟探索LincRNA-p21与食管癌发病关系及机制。目的:1.比较分析食管癌细胞EC109、EC9706和食管永生化上皮细胞Het-1A,以及食管癌组织和配对癌旁组织中LincRNA-p21的表达差异,探讨LincRNA-p21与食管癌发病风险的关系。2.分析LincRNA-p21对食管癌细胞株EC109生物学功能的影响。3.探讨LincRNA-p21调控靶p21蛋白影响食管癌细胞增殖的作用机制,为食管癌的基础研究和临床治疗提供更多的实验依据。方法:1.组织样本来源于2011-2012年招募的淮安市第一人民医院64例病理确诊的食管癌患者,采用RT-qPCR技术检测受试细胞(EC109、EC9706和Het-1A)、食管癌组织及其癌旁组织中LincRNA-p21的表达水平。应用单纯病例研究分析环境因素与LincRNA-p21表达改变之间的关系,分析LincRNA-p21的表达与食管癌发病风险的关联,以及LincRNA-p21与食管癌的发病位置、分化程度和淋巴结转移等病理危险因素的交互作用2.LincRNA-p21的生物信息学预测2.1使用在线lncRNA数据库如ChIPBase,NONCODE,starBase,LncRNADisease,DIANA-LncBase,Genecards等预测LincRNA-p21的靶基因。2.2应用生物信息学分析软件catRAPID(http://service.tartaglialab.com/page/Catrapid_group)在线预测靶蛋白分子p21与LincRNA-p21结合位点,分析二者结合能力及其结合信度。3.LincRNA-p21对食管癌细胞生物学功能的影响3.1构建LincRNA-p21过表达载体,使用缺陷型慢病毒包装后,转染EC109细胞,经嘌呤霉素筛选、RT-qPCR验证转染效率后,获得稳定表达LincRNA-p21的EC109细胞株;使用RT-qPCR检测过表达LincRNA-p21及其阴性对照的EC109细胞中LincRNA-p21的表达水平,同时采用CCK-8、EDU、流式细胞技术、Transwell迁移和侵袭分别检测稳定表达LincRNA-p21的EC109细胞的增殖、凋亡、周期、迁移、侵袭能力,以评价LincRNA-p21对食管癌细胞生物学行为的影响;3.2使用FISH和核质分离试剂盒分析LincRNA-p21在细胞核和细胞质的分布;4.LincRNA-p21影响食管癌细胞增殖的生物学机制4.1采用RT-qPCR和WB检测食管癌组织和细胞中的p21的表达水平以及上调LincRNA-p21后食管癌细胞EC109中p21的水平。4.2使用Western Blot分别检测过表达LincRNA-p21的EC109细胞及其阴性对照中的周期相关蛋白的表达。4.3采用p21蛋白抑制剂UC2288抑制p21蛋白的表达后,经CCK-8、EDU、流式细胞技术检测EC109细胞的增殖、凋亡、周期改变。结果:1.LincRNA-p21在食管癌组织和细胞中低表达1.1本研究食管癌组织中LincRNA-p21表达显著降低,表达量为癌旁组织的45.10%(P<0.05),LincRNA-p21低表达增加食管癌的发病风险,OR=3.76(2.20,9.18);LincRNA-p21异常表达在淋巴结转移和肿瘤位置的分布不同(P<0.05),然而,LincRNA-p21与吸烟和饮酒没有关联。1.2 RT-qPCR结果显示,EC109和EC9706中LincRNA-p21水平分别为Het-1A的18.3%和32.5%(P<0.05);p21的mRNA水平分别为Het-1A的48.0%和42.3%倍。慢病毒转染后,LincRNA-p21相对表达量增加约14748.91倍(P<0.05),p21的mRNA上调约1.83倍(P<0.05)。2.LincRNA-p21生物信息学预测结果2.1 LincRNA-p21全长2882 bp,位于第六号染色体(chr6):36664421-36667296,UCSC基因上下文分析显示p21/Cdkn1a位于LincRNA-p21下游;数据库中预测到LincRNA-p21的靶共有10个,其中9个蛋白,1个miRNA。文献报道的靶标共有12个,其中5个蛋白靶标,7个miRNA靶标。2.2 RNA-蛋白质结合预测软件catRAPID(http://service.tartaglialab.com/page/catrapid_group)在线预测发现LincRNA-p21在其片段1724-2750nt处与p21蛋白20-80氨基酸处结合能力最强。3.LincRNA-p21对食管癌细胞生物学功能的影响3.1CCK-8和EDU染色成像法结果显示,过表达LincRNA-p21及其阴性对照组细胞增殖率分别(64.69±3.78)%和(44.40±1.78)%,LincRNA-p21明显抑制EC109细胞增殖能力。3.2流式细胞术(PI染色)结果显示,过表达LincRNA-p21及其阴性对照组细胞周期细胞率分别是:G1期(59.63±0.22)%和(51.76±1.30)%;S期(24.80±0.28)%和(30.66±0.64)%;G2期(15.57±0.67)%和(17.57±0.76)%。统计分析结果显示,三期差异均存在统计学意义(P<0.05)。G1期细胞增加,S期减少,LincRNA-p21将EC109细胞周期阻滞在G1/S期,细胞DNA合成受阻,抑制食管癌细胞增殖活动。3.3流式细胞术(Annexin V-7AAD/VPC标记)结果显示,过表达LincRNA-p21及其阴性对照组细胞凋亡率分别是(10.43±0.25)%和(4.87±0.78)%;凋亡率差异有统计学意义(P<0.05)。3.4 Transwell小室迁移实验结果显示,过表达LincRNA-p21及其阴性对照组穿膜细胞数分别是20.90±1.57和32.70±2.26,LincRNA-p21抑制EC109细胞的迁移能力。3.5 Transwell小室侵袭实验结果显示,过表达LincRNA-p21及其阴性对照组穿基质膜细胞数分别是11.70±2.35和22.20±2.72,LincRNA-p21抑制EC109细胞的侵袭能力。3.6 FISH和核质分离RT-qPCR结果显示LincRNA-p21主要定位于食管癌细胞质。4.LincRNA-p21上调p21水平诱导食管癌EC109细胞G1/S期阻滞4.1 LincRNA-p21在mRNA和蛋白水平上调p21。4.2 Western Blot结果显示LincRNA-p21促进cdc-25c和p-cdc-2蛋白表达,抑制cyclin D蛋白表达。4.3抑制p21蛋白后,过表达LincRNA-p21的EC109细胞的增殖和G1/S期阻滞被反转。结论:1.LincRNA-p21在食管癌中扮演肿瘤抑制因子的角色。LincRNA-p21在食管癌组织和细胞中表达下调,在食管癌细胞EC109中上调LincRNA-p21,发现LincRNA-p21抑制食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,改变细胞周期分布并诱导G1/S期阻滞。2.机制研究发现,LincRNA-p21在mRNA和蛋白水平促进p21表达,抑制下游cyclin D蛋白表达、促进cdc-2磷酸化,诱导食管癌细胞G1/S期阻滞从而抑制细胞增殖。3.FISH结合核质分离试剂盒对LincRNA-p21进行亚细胞定位发现其位于EC109细胞质,提示LincRNA-p21可能成为食管癌诊断的新型辅助标志。