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鹿茸是哺乳动物中惟一能够完全再生的器官,且能够无癌变迹象的快速增殖生长,是人类医学领域开展创伤修复、器官再生和肿瘤等研究的独特模型。鹿茸通常是鹿科动物雄性的特征,而驯鹿则是雌、雄都能生茸的鹿科动物。驯鹿的雌、雄鹿茸之间,以及其与其他鹿科动物雄性鹿茸之间有诸多明显的表观差异,比如分支大小、数量、粗细、复杂程度及再生脱落时间等。从遗传上探究、阐明这些表观差异的内在分子机制,已经是科学界极富挑战力的焦点科学问题。参与调控鹿茸生长发育的基因正在被逐一发现,其调控机制与功能也在被逐步揭示,这为进一步研究这些基因在“同一鹿种鹿茸组织与其他组织、不同鹿种鹿茸组织、雌雄鹿茸组织(仅驯鹿)”的调控与表达差异奠定了基础。DNA甲基化作为一种重要的表观遗传机制,可以通过调控目标基因的转录和表达,在生命过程中起到重要调控作用。因此,从分析鹿茸DNA甲基化的角度入手,研究DNA甲基化差异,将对在分子水平阐明驯鹿的雌、雄鹿茸之间,以及其与梅花鹿等其他鹿科动物鹿茸之间表观遗传机制上的差异具有重要科学价值和意义。本研究以同龄健康的成年雌雄驯鹿和梅花鹿为研究对象,以雌雄驯鹿、梅花鹿茸顶端间充质及血液组织为试验材料,选取10个与鹿茸生长调控相关并极有可能直接导致表观遗传差异的基因(COL1A1、COL6A3、DKK1、IGF1、KGF、NGF、OPN、RUNX1、S100A4、STAT1),对其启动子区进行克隆及生物信息学分析,在此基础上利用BSP技术研究10个基因在雌雄驯鹿、梅花鹿的鹿茸顶端间充质及其血液组织的DNA甲基化模式,进而分析在不同组织间的DNA甲基化差异并探究其所致表观差异的调控机理,研究结果如下:1、成功克隆得到驯鹿源、梅花鹿源的10个鹿茸相关基因部分启动子序列,且与白尾鹿的同源性均达到98.3%以上,并与牛、羊等偶蹄目动物也有较高同源性(85.8%以上),都具有核心启动子元件、CpG岛和核心启动子区域或位点等启动子的典型特征。2、10个基因在相同组织、同一基因在不同组织中都有不同的DNA甲基化模式,甲基化率(0.00±0.00)%～(91.70±1.39)%。COL6A3、NGF、OPN、S100A4 基因在各组织都发生不同程度的DNA甲基化,COL6A3基因在血液组织的甲基化率最高[(73.50±0.75)%～(83.53±2.99)%]。COL1A1、DKK1、IGF1、KGF、RUNX1、STAT1 基因并非在所有组织都发生DNA甲基化,如KGF基因在雄性驯鹿和梅花鹿茸甲基化率分别为(45.53±3.87)%、(42.20±1.91)%,而在雌性驯鹿茸未发生DNA甲基化;RUNX1基因则只在雌性驯鹿茸中发生低水平的DNA甲基化[(3.33±1.44)%]。3、在10个基因启动子序列的CpG二核苷酸位点的DNA甲基化模式中,不同基因的甲基化受到各自基因启动子序列中CpG二核苷酸位点甲基化程度的影响;而同一基因启动子区在不同组织的DNA甲基化模式受到CpG二核苷酸位点甲基化差异的影响。4、比较分析雌性驯鹿、雄性驯鹿、梅花鹿的鹿茸顶端间充质及其血液组织的DNA甲基化差异发现:雌、雄驯鹿茸顶端间充质组织:(1)雌性在COL6A3、NGF、OPN、RUNX1、S100A4基因的甲基化率显著高于雄性(P<0.05),其在雌、雄性的甲基化率分别是(16.83±1.10)%、(6.63±1.31)%,(33.90±3.57)%、(17.20±3.57)%,(36.83±5.86)%、(18.10±0.87)%,(3.33±1.44)%、(0.00±0.00)%,(27.80±1.28)%、(21.67±2.17)%;(2)雌性在 IGF1、KGF 基因的甲基化率显著低于雄性(P<0.05),其在雌、雄性的甲基化率分别是(6.40±0.52)%、(7.20±1.28)%,(0.00±0.00)%、(45.53±3.87)%;(3)雌、雄性驯鹿在COL1A1基因均未发生甲基化,在其它2个基因的甲基化率无显著性差异(P>0.05)。驯鹿、梅花鹿茸顶端间充质组织:(1)雌性驯鹿在COL6A3、NGF、RUNX1、S100A4基因的甲基化率显著高于梅花鹿(P<0.05),而在KGF基因的甲基化率显著低于梅花鹿(P<0.05),其在雌性驯鹿、梅花鹿的甲基化率分别是(16.83±1.10)%、(7.10±1.93)%,(33.90±3.57)%、(21.57±1.21)%,(3.33±1.44)%、(0.00±0.00)%,(27.80±1.28)%、(5.03±1.44)%,(0.00±0.00)%、(42.20±1.91)%;(2)雄性驯鹿在 IGF1、KGF、S100A4 基因的甲基化率显著高于梅花鹿(P<0.05),在COL1A1、NGF、OPN基因的甲基化率显著低于梅花鹿(P<0.05),而在RUNX1基因均未发生甲基化,其在雄性驯鹿、梅花鹿的甲基化率分别是(2.23±0.92)%、(0.00±0.00)%,(91.70±1.39)%、(90.30±0.52)%,(21.67±2.17)%、(5.03± 1.44)%,(0.00±0.00)%、(2.40±0.00)%,(17.20±3.57)%、(21.57±1.21)%,(18.10±0.87)%、(35.70±1.40)%,(0.00±0.00)%、(0.00±0.00)%。在其余基因的甲基化率无显著性差异(P>0.05)。雌、雄驯鹿血液组织:(1)雌性在COL6A3、OPN基因的甲基化率显著高于雄性(P<0.05),在COL1A1、KGF、S100A4基因的甲基化率显著低于雄性(P<0.05),其在雌、雄性的甲基化率分别是(83.53±2.99)%、(77.10±4.03)%,(80.00±1.40)%、(52.40±0.87)%,(3.47±0.61)%、(6.40±0.00)%,(86.70±0.00)%、(91.70±1.39)%,(6.70±0.90)%、(10.03±2.25)%;(2)雌、雄性在其它5个基因的甲基化率均无显著性差异(P>0.05)。驯鹿、梅花鹿血液组织:(1)雌性驯鹿在COL6A3基因的甲基化率显著高于梅花鹿(P<0.05),而在COL1A1、KGF基因的甲基化率显著低于梅花鹿(P<0.05),其在雌性驯鹿、梅花鹿的甲基化率分别是(83.53±2.99)%、(73.50±0.75)%,(3.47±0.61)%、(5.87±0.46)%,(86.70±0.00)%、(90.30±0.52)%;(2)雄性驯鹿仅在OPN基因的甲基化率显著低于梅花鹿(P<0.05),其甲基化率分别为(52.40±0.87)%、(78.07±2.97)%;(3)雌雄性驯鹿、雌性驯鹿与梅花鹿、雄性驯鹿与梅花鹿分别在5个、7个、9个基因的甲基化率均无显著性差异(P>0.05)。雌性驯鹿茸顶端间充质与其血液组织:鹿茸顶端间充质组织在COL1A1、COL6A3、IGF1、KGF、OPN、STAT1基因的甲基化率显著低于其血液组织(P<0.05),在NGF、RUNX1、S100A4基因的甲基化率显著高于其血液组织(P<0.05),其在鹿茸间充质、血液组织的甲基化率分别是(0.00±0.00)%、(3.47±0.61)%,(16.83±1.10)%、(83.53±2.99)%,(0.00±0.00)%、(6.40±0.52)%,(0.00±0.00)%、(86.70±0.00)%,(36.83±5.86)%、(80.00±1.40)%,(0.27±0.12)%、(1.53±0.29)%,(33.90±3.57)%、(27.33±119)%,(3.33±1.44)%、(0.00±0.00)%,(27.80±1.28)%、(6.70±0.90)%。雄性驯鹿茸顶端间充质与其血液组织:(1)鹿茸顶端间充质组织在COL1A1、COL6A3、IGF1、KGF、NGF、OPN、STAT1基因的甲基化率显著低于其血液组织(P<0.05),在S100A4基因的甲基化率显著高于其血液组织(P<0.05),其在鹿茸间充质、血液组织的甲基化率分别是(0.00±0.00)%、(6.40±0.00)%,(6.63±1.31)%、(77.10±4.03)%,(2.23±0.92)%、(7.20±1.28)%,(45.53±3.87)%、(91.70±1.39)%,(17.20±3.57)%(29.23±1.37)%,(18.10±0.87)%、(52.40±0.87)%,(0.20±0.20)%、(1.70±0.20)%,(21.67±2.17)%、(10.03±2.25)%;(2)雌、雄性驯鹿茸顶端间充质与其血液组织分别在9个、8个基因上的甲基化率有显著性差异(P<0.05)。梅花鹿茸顶端间充质与其血液组织:鹿茸顶端间充质组织在COL1A1、COL6A3、IGF1、KGF、NGF、OPN、S100A4、STAT1基因的甲基化率显著低于其血液组织(P<0.05),其在鹿茸间充质、血液的甲基化率分别是(2.40±0.00)%、(5.87±0.46)%,(7.10±1.93)%、(73.50±0.75)%,(0.00±0.00)%、(5.83±1.44)%,(42.20±1.91)%、(90.30±0.52)%,(21.57±1.21)%、(28.57±1.40)%,(35.70±1.40)%、(78.07±2.97)%,(5.03±1.44)%、(8.90±0.52)%,(0.00±0.00)%、(1.40±0.36)%。基因的DNA甲基化水平差异与其所发挥的调控功能差别密切相关。本研究针对鹿茸生长发育调控相关基因DNA甲基化差异的研究结果,为揭示雌雄驯鹿茸间、及其与梅花鹿茸间的表观差异及相关生茸调控机理提供了基础理论积累,同时对进一步开展组织器官再生、损伤修复及肿瘤癌症等一系列人类医学问题的研究具有积极意义。