论文部分内容阅读
F18+E.coli是引起猪水肿病（Eedema disease of swine，ED）及大肠杆菌性断奶仔猪腹泻（post-weaning diarrhea，PWD）的重要病原，猪水肿病及大肠杆菌性断奶仔猪腹泻是一种世界范围内广泛存在的并造成断奶仔猪死亡的重要疾病。应用疫苗免疫以及对猪群的F18+E. coli血清学检测是预防和控制该病的关键，然而到目前为止，市面上还没有商品化的疫苗及血清学检测方法。本研究开展了对F18+ E. coli的病原分离鉴定、主要毒力基因分析、检测方法的建立和基因工程亚单位疫苗及亚单位菌苗的研究，主要研究内容如下：1．F18+ E. coli的分离鉴定及Ee株的主要毒力基因的序列分析利用FedA-PCR及凝集试验，从临床分离的284株大肠杆菌中检测出12株F18+E. coli，同时，从130份健康育肥猪肛拭子样本中分离、筛选检测出24株F18+ E. coli。利用标准血清对分离的36株菌株进行O抗原血清分型，分离株分为17种血清型，其中O8占8.3％（3／36）、O138占8.3％（3／36）、O101占8.3％（3／36）及O9占5.6％（2／36）。耐药性检测显示36株分离菌对14种药物表现出不同的耐药性，6耐以上的菌株占74.6％（27／36），其中最多为10耐（6／36，占17.4％）。我们对分离于湖北武汉的一株强毒株（Ee株）的主要毒力基因（SLT-IIeB、SLT-IIeA、FedF及FedA）进行了克隆与序列分析，并与国际标准株E. coli S1191相应核苷酸序列进行了比较。2．FedF-ELISA的建立及应用在将Ee株黏附素FedF融合表达以及重组蛋白GST-FedF纯化的基础上，利用F纯化蛋白包被ELISA板，建立了F18+ E. coli抗体的ELISA检测方法。对90份阴性血清进行检测，确定该方法的阴阳性临界值为0.381。将该方法与细菌分离鉴定进行了比较，结果二者的总的符合率为92.8％。对灭活菌苗免疫猪免疫血清及F18+ E. coli感染猪感染血清检测结果显示仔猪感染或接种疫苗后分别为1周或2到3周后出现抗体。利用FedF-ELISA检测方法对来自24个猪场1421份临床送检血清进行检测，测得F18+ E. coli的血清学阳性率为30.4％（432／1421）。利用该检测方法对来自健康猪群2593份血清进行了检测，数据表明F18+ E. coli的感染在健康猪群都存在；总的阳性率依次为母猪46.36％（159／343），初生猪40.4％（324／750），保育猪15.73％（118／750），及育肥猪26.0％（185／750）。进一步统计学分析表明不同猪场以及不同猪群的F18+ E. coli的血清学阳性率差异显著，而且母猪F18+ E. coli血清学阳性率与猪场的血清学阳性率存在正相关。3．SLT-IIeB与FedF融合蛋白对小鼠的免疫原性根据猪水肿病大肠杆菌Ee株主要免疫原性片段SLT-IIeB和FedF的基因序列，利用PCR技术克隆目的片段，并将SLT-IIeB和FedF基因依序串联于谷胱甘肽—S—转移酶（GST）表达系统的GST下游，在大肠杆菌中成功获得了大小约为62kDa融合蛋白GST-SF，Western blot检测证实表达的融合蛋白具有良好的免疫反应活性。以纯化的融合蛋白为抗原免疫新西兰兔制备血清，血清体外活性试验表明，所制备的抗血清能中和Ee株水肿毒素对Vero细胞的病变效应；黏附抑制试验证实抗血清能抑制Ee株对猪小肠刷状缘细胞的黏附。将融合蛋白免疫小鼠，并以SLT-IIeB和FedF蛋白为对照。结果表明，融合表达策略能提高SLT-IIeB和FedF各自的免疫原性，能够诱发较好的免疫反应，并能提供对Ee株5LD50致死剂量的70％保护率。4．亚单位菌苗对小鼠的保护效力利用大肠杆菌表达猪水肿病大肠杆菌的水肿毒素SLT-IIeB与F18菌毛黏附素FedF融合蛋白，将表达蛋白纯化并复性，再加入自行分离的我国流行的猪水肿病大肠杆菌Ee株（O139），和油乳佐剂乳化后制成亚单位菌苗，免疫昆明鼠，间隔2周加强免疫1次。每次免疫后采血检测毒素及黏附素的ELISA抗体和Ee株的菌体凝集效价，第2次免疫3周后用5LD50的猪水肿病大肠杆菌Ee株进行攻毒。结果亚单位菌苗组与灭活菌苗组ELISA抗体水平有显著性差异，两种疫苗对Ee的保护力分别为90％和70％。结果表明新型亚单位菌苗对强毒株攻毒具有较好的保护力。5．亚单位菌苗对仔猪的保护效力利用大肠杆菌表达大肠杆菌Ee株的水肿毒素B亚单位SLT-IIeB与F18菌毛黏附素FedF融合蛋白，将重组蛋白纯化并复性，再加入自行分离的我国流行的猪水肿病大肠杆菌Ee株（O139），和油乳佐剂乳化后制成亚单位菌苗，间隔三周两次免疫仔猪。利用ELISA检测针对SLT-IIeB与FedF的抗体，利用微量凝集试验检测菌体抗体凝集效价；利用商品化试剂盒对攻毒后72h血清中生化指标进行检测；对存活猪进行日增重测定；保留死亡猪病理组织，两周后剖杀存活猪并保留组织，进行病理学检验。二次免疫3周后经前腔静脉以160×109CFU的Ee株进行攻毒。结果显示亚单位菌苗组具有较高的毒素抗体、菌体凝集效价、日增重、较高的保护效率以及较低的组织病理学积分。总之亚单位菌苗无论是保护效率、抗体水平、日增重还是在减轻临床病理变化上都优于常规灭活苗。