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家蚕BmOVO是一种转录因子,在调节卵巢发育中发挥作用。为了探讨BmOVO四种剪接亚型的转录调节活性及其不同的结构域对转录调节活性的影响,以pFastBacTMDual为基础载体构建了4个荧光素酶luc基因表达载体pFast-potu-Luc-ie1-ovo,其中,Bmovo基因的4种剪接亚型(Bmovo-1,2,3,4)分别由家蚕杆状病毒的ie-1启动子控制、荧光素酶luc基因由家蚕卵巢肿瘤otu基因启动子控制。将荧光素酶luc基因表达质粒和内参pRL-TK质粒共转染家蚕BmN培养细胞,通过双荧光素酶活性检测研究BmOVO对otu基因启动子活性的调节作用。结果显示,BmOVO-2、BmOVO-3和BmOVO-4对otu启动子活性有正调节作用,其中BmOVO-2转录激活的活性最高;而转染低剂量的pFast-potu-Luc-ie1-ovo1时,对otu启动子的转录激活作用不明显,但随着转染剂量的增加有增强otu启动子活性的趋势。另外,本研究还通过不同组合的双荧光素酶基因表达载体共转染培养细胞研究其对otu启动子活性的调节作用,发现pFast-potu-Luc-ie1-ovo1分别与pFast-potu-Luc-ie1-ovo2、pFast-potu-Luc-ie1-ovo3、pFast-potu-Luc-ie1-ovo4共转染细胞后,与单独转染pFast-potu-Luc-ie1-ovo对照区相比,otu启动子的转录活性被显著提高,表明BmOVO-1可能与BmOVO-2、BmOVO-3、BmOVO-4等相互作用提高otu启动子的转录活性。BmOVO的C-末端有C2H2锌指基序,N-末端结构域不同亚型间存在差异,为了探讨BmOVO N端各结构域的功能,在对BmOVO-1蛋白序列进行结构域分析的基础上,根据结构域特点对Bmovo-1基因进行了截短,并构建含不同截短Bmovo-1序列表达盒的荧光素酶基因表达载体。通过转染细胞后荧光素酶活性分析,发现BmOVO-1蛋白的N端第1、3个酸性结构域(A1,13-25aa;A3,180-191aa)起转录抑制作用,第2个酸性结构域(A2,30-51aa)、第1个碱性结构域(B1,253-311aa)的转录调控作用不明显,第4、5个酸性结构域(A4,339-352;A5,362-372)可能起转录激活作用;将结构域A1与转录激活因子BmOVO-2的N端融合,发现融合后的重组BmOVO-2的转录激活作用急剧下降,进一步说明A1有抑制靶基因的转录作用。另外,Bmovo是否能通过其他基因互作调节靶基因表达仍不明了。以往的研究显示,果蝇编码的小分子多肽Tal对Shavenbaby的功能有调控作用,家蚕中是否存在与果蝇中相类似的调节方式?家蚕tal-like基因的转录本中具有4个编码tal-like的读码框(a1-a4区)和1个编码33aa的b区。在本研究中,将tal-like基因全长cdna序列(tal)、带有5’非编码序列的具有a1-a4区和b区的cdna序列(5a1-4+b)、具有a1-a4区和b区的cdna序列(a1-4+b)以及含有b区及其下游序列(b)分别克隆进昆虫细胞表达载体pizt-v5/his分别构建tal-like基因表达载体pizt/v5-his-tal、pizt/v5-his-5a1-4+b、pizt/v5-his-a1-4+b、pizt/v5-his-b,转染培养细胞,双荧光素酶基因报告系统检测结果显示,转染上述质粒的细胞中的otu启动子的活性明显降低,提示家蚕tal-like小肽可下调otu启动子的活性;tal-like基因表达载体与pfast-potu2-2-luc-ie1-ovo1的共转染实验结果显示,tal-like小肽(tal、5a1-4+b和a1-4+b)下调的otu启动子的活性能被bmovo-1挽救;将bmovo-1蛋白的n端(28aa)和红色荧光蛋白(dsred)融合表达质粒pizt/v5-his-ovodsred与tal-like基因表达质粒共转染培养细胞,通过细胞荧光观察和westernblotting检测发现,tal-like小肽(5a1-4+b和a1-4+b)能激发bmovo-1的n端的水解。另外,通过双荧光素酶报告系统检测还发现tgf-β家族成员dpp和daw、wnt信号通路的调控因子酪氨酸激酶样的孤独受体(ror2)、信号传导及转录激活因子(stat)和类胰岛素基因bbx-b8对bmovo-2转录激活有拮抗作用。这些结果为我们理解bmovo对靶基因表达的精细调控提供了线索。为鉴定bmovo蛋白在otu基因启动子上的结合位点,根据果蝇ovo靶位点的保守序列(ttacmgttaca,m=a/c),利用jasparcore(http://jaspar.genereg.net/cgi-bin/jaspar_db.pl)分析预测了otu启动子序列(babh01009636)中的bmovo的可能结合位点,发现有3个候选结合位点,序列分别为:gtaccgttgta(ce1,20496-20506区域)、aggccgttaag(ce2,20598-20608区域)、cctgaactaca(ce3,20728-20738区域)。凝胶阻滞实验(emsa)结果显示,bmovo-2c端的重组蛋白(400-577aa)与otu启动子上的ce1位点结合能力最强,证明bmovo能直接结合到otu基因启动子上从而调控otu基因的表达。另外,我们还发现otu启动子还能与细胞核内的其他蛋白结合,将ce1中的第2位碱基t突变成c(t2->c),其与核蛋白的结合能力减弱,而将第11位碱基a突变成g(a11->g),其与核蛋白的结合能力增强。不同截短的otu启动子控制荧光素酶基因的报告系统检测显示,ce1、ce2缺失对bmovo-1调节otu启动子活性的影响不明显;当ce1缺失时,bmovo-2介导调节的otu启动子活性骤减,但同时ce1和CE2缺失时,对BmOVO-2介导调节的otu启动子活性影响不明显;当缺失CE2时,BmOVO-3介导调节的otu启动子活性下降,但缺失CE1时,对BmOVO-3介导调节的otu启动子活性影响不明显。表明otu基因启动子活性不仅受到其具有的顺式调控元件的影响,还受到转录因子BmOVO和其他反式作用因子的调控。CE1位点不同突变/缺失的otu启动子控制荧光素酶基因的报告系统检测显示,当T2->G或C时,BmOVO-2介导调节的otu启动子活性增强,由T2->A时,对otu启动子活性无明显影响;当A3->T、G或C时,otu启动子活性减弱;当第A11->T或C时,otu启动子活性下降,当A11->G时,otu启动子活性升高;当分别缺失T2、A3和A11时,otu启动子活性基本没有变化,但同时缺失这三个碱基时,otu启动子活性升高。这些实验结果为理解BmOVO对靶基因的精细调控提供了分子线索。