2010年于我国东南部沿海地区鸭养殖区爆发了抗原为鸭坦布苏病毒的传染性疾病,后来迅速流行于全国各地的主要鸭养殖区等(浙江、广州、广西、安徽、江苏、山东、河北)。鸭群被感染后,症状表现产蛋下降、采食量降低、生长缓慢和典型的神经症状,鸭群感染率为100%,死亡率高达10~30%,对我国的鸭养殖业造成了巨大的经济损失和对公共卫生安全产生了安全隐患。鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu virus,DTMUV),属于黄病毒科,黄病毒属。黄病毒属包括乙型脑炎病毒(Janpanese encephalitis virus,JEV)、登革热病毒(Dengue virus,DENV)、西尼罗病毒(West Nile virus)、黄热病毒(yellow fever virus)等等。DTMUV基因是一条正链RNA,包含两端的非编码区(5’-UTR和3’UTR)和一个开放读码框,分别编码结构蛋白:衣壳蛋白(C)、膜蛋白前体/膜蛋白(pr M/M)和包膜糖蛋白(E),7个非结构蛋白。目前已经从鸡、鹅、鸽子、鸟和蚊子体内分离出了此病毒,说明了DTMUV很可能已经获得了跨种传播的能力。根据最新研究DTMUV在哺乳动物细胞上连续传代、小鼠体内正常复制尤其是肝、脾脏、脑等部位,小鼠临床症状比较明显,表现为黄病毒中典型的神经症状。另外由于黄病毒为人畜工感染的重要病原,而DTMUV也可通过蚊虫传播,所以其很可能是一种潜在的人类病原体,非常有必要做好DTMUV的跨种传播感染人预防工作,研究其致病性和开发新的疫苗。本研究是通过探寻DTMUV中关键毒力位点,来探究DTMUV的致病机制和减毒策略,给减毒活疫苗的研制提供新的减毒靶点,为DTMUV的爆发流行和跨种传播人做好预防工作本研究主要包括四部分:一、DTMUV病毒的毒力位点分析与鉴定本实验通过小鼠颅内连续传代DTMUV病毒,发现了病毒的蚀斑能力出现了减弱的生物学。通过蚀斑纯化技术,分离出DTMUV-L与DTMUV-S,发现DTMUV-S的蚀斑能力和神经毒力有明显减弱的现象。通过核苷酸序列比对发现,突变病毒的在E 388位有一个丝氨酸(S)到精氨酸(R)的突变,其他核苷酸的突变位于非结构蛋白NS1和NS5中。根据有关研究证明,黄病毒属中的E蛋白是病毒关键的毒力部位,在病毒感染过程中具有细胞吸附、膜融合等重要作用,包含多种抗原表位,是中和抗体结合的区域,所以确定了E蛋白388位突变位点的研究路线。二、突变感染性克隆p S388R的构建本实验室已将DTMUV的结构基因pr M和E基因嵌合在乙脑病毒的感染性克隆载体上E70上,构建了嵌合感染性克隆p CJDTMUV。为探究该E388突变是否对鸭坦布苏病毒的生物学特征有影响,在感染性克隆质粒p CJDTMUV基础之上,本实验利用分子克隆技术,将E388位氨基酸由S突变为R,构建了携带突变位点的感染性克隆质粒p S388R,并成功拯救获得携带该突变的恢复病毒r S388R。三、恢复病毒r S388R与亲本病毒r WT株病毒的体外病毒特征对比本研究评价了恢复病毒r S388R体外水平的生物学特征。生长曲线上BHK-21、C6/36和SY-SH5Y细胞上没有明显的差异,但是在Vero,DF-1细胞系中发现r S388R的生长曲线明显减弱;蚀斑形态上看r S388R病毒的蚀斑明显减小;间接免疫荧光实验表明两株病毒在表达自身结构蛋白上没有明显差异;温度稳定性实验发现r S388R对温度的变化更加敏感,病毒的结构稳定性变弱;病毒的吸附实验表明两株病毒没有明显的差异,但肝素受体结合实验中发现携带S388R突变的病毒是依赖于结合宿主细胞中的硫酸乙酰肝素(HS)受体来完成病毒感染过程。四、恢复病毒r S388R与亲本病毒r WT的动物水平的评价动物实验结果说明r S388R病毒株的神经毒力和神经侵袭力都明显弱于r WT亲本株,能够有效的诱导机体产生Ig G抗体和中和抗体,而且具有良好的免疫保护结果。综上所述,我们发现并探究了鸭坦布苏病毒E388突变对病毒生物学特征和致病机制的影响,构建了携带突变位点的感染性克隆,证明了S88R的突变对鸭坦布苏病毒是具有非常重要影响的,为病毒的疫苗研制提供了新的策略。