研究背景糖皮质激素(glucocorticoids,GC)因其抗炎、抑制免疫、抗休克和抗毒等药理作用,广泛应用于治疗各种免疫炎症性疾病,包括哮喘、慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)、肺间质纤维化等呼吸系统疾病。当GC与糖皮质激素受体(glucocorticoids receptor,GR)结合后,其伴侣蛋白热休克蛋白90(hot shock protein90,HSP90)构象发生改变,GRα-GC复合物与HSP90等配体成分分离,HSP90脱落,形成激素-受体复合物,GRα核易位进入细胞核,在胞核内与激素应答基因启动区的激素反应元件(glucocorticoid response elements,GRES)结合,从而导致相应基因的转录活性增强并调控激素相关基因表达,产生生理及药理作用。糖皮质激素的作用包括与受体结合及GC与GR结合之后引起的核转位过程是极其复杂的,机体的功能状态及细胞所处的微环境均可影响其作用发挥。哮喘及慢性阻塞性肺病急性发作均存在不同程度的低氧血症,前期研究显示低氧时间依赖性抑制肺泡上皮A549细胞GRα的表达,但其信号通路及机制不明,且低氧是否会影响GRα核转位尚不清楚。研究目的本研究建立哮喘小鼠动物模型,明确哮喘急性发作是否存在GRα的表达改变及低氧血症。体外实验以人肺泡上皮A549细胞为模型,观察低氧对GRα表达及MAPK信号通路的影响,靶向干预MAPK信号通路,观察GRα表达的变化,揭示低氧抑制GR表达的可能通路。观察低氧对TLR2信号通路及Hif-1的影响,分别靶向干预TLR2信号通路及Hif-1,检测TLR2信号蛋白、Hif-1及GR表达的变化,揭示低氧抑制GR表达的可能通路及TLR2与Hif的内在关系。转染GFP标记的GRα质粒入A549细胞,观察低氧对GRα核转位的影响。本研究旨在揭示低氧抑制GRα表达及核转位的分子机制,为激素抵抗型哮喘的靶向干预提供理论依据和治疗方向。研究方法1.建立OVA哮喘小鼠模型,实验分组包括正常对照组,哮喘组,TLR2-/-哮喘组,免疫组化方法及Western Blot检测GRα及Hif-1蛋白表达的变化。2.低氧培养A549细胞人肺泡上皮A549细胞放入普通培养箱(37℃,95%空气,5%CO2),给予化学性低氧条件(COCL2,1200umol/L)培养0h,2h,4h,6h,8h,12h,24h。3.Western Blot法检测低氧对各组细胞GRα、Hif-1、TLR2及MAPK信号家族包括磷酸化c JNK、ERK,p38表达的影响;靶向干预MAPK信号通路蛋白,观察GRα表达的变化;转染Hif-1及TLR2si RNA质粒对之进行特异性干扰,检测MAPK信号通路蛋白及GRα的改变。5.以脂磷壁酸激活TLR2通路蛋白,观察TLR2信号通路激活状态下GRα、Hif-1及TLR2表达的变化;6.将A549细胞转染带绿色荧光标记的GFP-GRα质粒,运用活细胞动态工作站动态观察常氧及化学性低氧状态下糖皮质激素诱发GRα入核的时间及程度的变化。7.免疫共沉淀法检测低氧对GR-HSP90二聚体解离的影响。8.统计方法实验数据均采用均数±标准误表示,每部分实验均独立进行3次完成。多组间差异采用one-way ANOVA方法分析,两组之间差异采用独立样本t检验,采用SPSS19.0软件包进行数据分析,P<0.05表示差异有统计学意义。研究结果1.野生型哮喘小鼠肺组织中Hif-1表达显著增强,GRα的表达下降,免疫组化的结果显示哮喘小鼠模型肺组织Hif-1阳性表达的细胞比率显著高于正常组小鼠肺组织细胞,IOD值高于正常对照组;GRα阳性表达细胞比率显著低于正常组小鼠,IOD值低于正常对照组,上述结果提示哮喘小鼠肺组织较之正常小鼠肺组织存在低氧状态,并且GRα表达显著下降。TLR2-/-哮喘小鼠肺组织Hif-1阳性表达的细胞比率显著高于正常组小鼠肺组织;GRα阳性表达细胞比率显著低于正常组小鼠。2.低氧时间依赖性下调GRα表达、激活MAPK信号通路,伴随着Hif-1及TLR2表达上调。低氧培养(氯化钴1200umol/L)肺泡上皮A549细胞,培养不同时间,Western Blot观察不同时间点GRα和Hif-1蛋白表达的变化,发现随低氧作用时间延长,GRα表达逐渐下降,而Hif-1及TLR2表达显著上升。低氧呈时间依赖性激活p38,JNK及ERK通路。3.靶向抑制p38信号通路可抵抗低氧导致的GRα下调。靶向干扰Hif-1可以抑制p JNK、pp38及TLR2活化,并且上调GRα表达。分别预先加入SP600125,SB203580,U0126靶向抑制JNK,p38,ERK1/2信号蛋白,作用两小时后更换培养基,加入COCL2,作用12h,通过对蛋白的半定量分析,结果显示抑制p38信号通路后,低氧所导致的GRα下调可以得到一定程度的修复。靶向干扰低氧环境下激活的Hif-1及TLR2信号,Hif-1靶向干扰后,p ERK活化未受到抑制,而活化的pp38及p JNK受到显著抑制,且TLR2信号受到抑制。靶向干扰Hif-1可以上调低氧环境下受到抑制的GRα表达。TLR2靶向干扰后对GRα表达,Hif-1及MAPK信号家族的激活未有明显影响。4.低氧显著抑制GRα核转位。常氧状态下,细胞培养基中加入10-5DXM后,活细胞动态显示GRα迅速在10min内全部转移进入细胞核内,低氧培养A549细胞,同样加入10-5DXM入细胞培养基,显示GRα入核的速度明显减慢,并有一定比例的GRα不转移入细胞核。5.低氧抑制GRα与HSP的解离。我们利用HSP和GRα可以相互结合的原理,用HSP90特异性吸附GRα,然后用Westernblot方法检测GRα的表达量,实验分为低氧和常氧组,低氧状态下被HSP90吸附可以检测的GRα量显著高于常氧状态下的GRα表达量。说明在低氧状态下与HSP90结合的GRα多于低氧状态与HSP90的结合。7.LTA刺激可以引起TLR2表达上升,GRα表达降低,Hif-1信号表达未见明显变化。将A549细胞给予LTA处理,Western Blot检测发现TLR2信号激活,但对Hif-1蛋白无明显影响,GRα表达有一过性下降。研究结论:1.哮喘小鼠肺组织里的GRα表达显著低于正常的小鼠肺组织;相反Hif-1表达在小鼠肺组织中明显增高。2.低氧通过激活MAPK信号通路下调GRα的表达,应用p38MAPK特异性抑制剂,可以有效地恢复低氧条件下A549细胞GRα表达的下降。3.靶向干扰Hif-1抑制JNK及p38蛋白活性,上调GRα表达。4.脂磷壁酸处理细胞激活TLR2信号蛋白后,GRα表达有一过性下降,Hif-1蛋白表达没有变化。5.低氧显著抑制GRα入核,免疫共沉淀法证实低氧通过抑制GR与HSP解离而阻止GRα入核。