应激是一种全身性适应性反应，由内外环境因素或社会心理因素造成，又称为应激反应。大量研究已经证实，microRNA主要通过绑定目标mRNA在转录后层面抑制mRNA翻译或促进其降解，进而参与体内多种生物学过程的调控。有研究发现，多个microRNA参与应激反应并可能参与调控HPA轴活性，但microRNA对HPA轴的关键分子CRH是否有调控作用尚不清楚。　　综上所述，认为，有必要了解应激过程下丘脑microRNA的表达变化及其是否能在下丘脑调控CRH的表达进而影响HPA轴活性。　　目的：　　通过体内和体外实验，了解下丘脑参与应激过程维持HPA轴合适反应的关键因子—CRH表达调节的microRNA及其作用机制，为阐明应激过程HPA轴活性调节机制以及HPA轴活性过度增强所致的健康危害预防措施研究提供新的线索。　　方法：　　一、动物应激模型制作　　（一）热应激　　8周龄C57小鼠，适应性喂养后，随机分为对照组和实验组，实验组小鼠分别在40℃、相对湿度60%的高温舱内进行热暴露1天、3天、7天、14天，每天1h。　　（二）束缚应激　　8周龄C57小鼠，适应性喂养后，随机分为对照组和实验组，实验组小鼠分别放在管直径28mm，长105mm装置内进行束缚应激1天、3天、7天、14天，每天1h。各组小鼠在完成造模计划后，断头处死，收集血清和下丘脑备用。　　二、放射免疫法测定血清中皮质酮（corticosterone,CORT）,ACTH含量　　三、microRNA表达谱芯片　　采用microRNA表达谱芯片（Affymetrix GeneChip miRNA3.0Array），对热应激0天，1天，7天小鼠下丘脑样本进行microRNA表达谱检测，并且采用随机方差模型（RVM）进行差异microRNA筛选，使用的分析工具为MultiClassDif。　　四、实时定量荧光PCR　　在实验过程中使用Trizol提取出下丘脑组织和细胞的全部RNA，检测RNA的浓度，然后再反转录成cDNA；miRNA使用特殊的反转录引物，使miRNA反转录为cDNA。把cDNA，引物，SYBR green和除酶水充分混匀后，进行扩增。根据CT值，18s和U6分别作为动物、细胞和miRNA的内参照，先标准化后再进行分析。　　五、Western-blot　　提取肝脏组织或细胞的总蛋白时使用凯基全蛋白试剂盒，之后进行浓度的测定，变性，然后凝胶，电泳，转膜，封闭，一抗孵育：CRH抗体（1∶1000）、p-CREB抗体（1∶1000）、CREB（1∶1000）、内参照抗体（β-actin抗体，1∶3000），漂洗后，孵育二抗，漂洗后，显像，进行灰度分析。　　六、小鼠下丘脑原代细胞和HT-22培养　　小鼠下丘脑原代细胞购自上海中桥新舟生物技术有限公司，在用多聚左旋赖氨酸预处理的培养瓶和多孔板中用原代神经元培养系统培养，HT-22在10%胎牛血清，1%的双抗（青霉素和链霉素混合液）的高糖DMEM中培养。在5%CO2，37℃培养箱中培养细胞。培养液的更换周期为1－2天。　　七、细胞转染　　小鼠下丘脑原代细胞转染：分别以50uM的浓度使用miR-212agomir，agomir载体对照和100uM的浓度使用miR-212antagomir，antagomir载体对照，转染进小鼠下丘脑原代细胞进行miR-212的过表达和抑制;　　小鼠海马细胞系HT-22：分别以50uM的浓度将miR-212mimics和100uM的浓度将miR-212inhibitors及其各自的阴性对照转染进HT-22细胞中，过表达和抑制miR-212。转染CREB过表达质粒的浓度为3ug/ml。　　八、双荧光素酶报告基因　　等HT-22细胞在96孔板上生长至差不多50%时，将含有miR-212模拟物共转染的野生型或突变型CRH3UTR的GP-miRGLO（Genepharma，Shanghai，China）的质粒或阴性对照转染到HT-22细胞。转染48小时后，用双荧光素酶报告基因测定系统（Promega，Mannheim，Germany）测定细胞裂解成荧光素酶活性。使用萤火虫荧光信号强度/海肾荧光素酶信号强度表示相对荧光素酶活性。　　结果：　　一、在反复应激过程中随着下丘脑miR-212表达逐渐升高，CRH表达先升高后下降　　（一）反复热应激小鼠下丘脑microRNA表达谱检测及生物信息学分析　　采用miRNA芯片技术检测了反复热应激小鼠下丘脑基因表达谱，发现热应激0、1、7天小鼠下丘脑内有41种miRNAs表达量发生明显变化，其中miR-212表达呈逐步升高状态。RT-PCR检测结果与芯片检测结果一致。通过生物信息学预测，41种表达变化的miRNAs中只有miR-212存在与HPA轴关键因子－CRH3UTR的结合位点。　　（二）反复热应激及束缚应激小鼠下丘脑miR-212、CRH表达量以及血清ACTH、GC含量检测　　为了明确反复应激时miR-212的表达变化及HPA轴活性的变化，增加了应激模型种类和反复应激的时间，对热应激、束缚应激0，1，3，7，14天小鼠的相关指标进行检测。结果表明，不论是热应激还是束缚应激，小鼠下丘脑miR-212表达从应激1天到14天不断升高，而下丘脑CRH的表达量及血清ACTH、CORT水平在应激1至3天逐步升高，在应激7天至14天其升高幅度逐渐缓解。　　二、MIR-212对CRH表达调控作用及其机制　　（一）小鼠下丘脑原代细胞及海马细胞HT-22过表达或抑制mir-212影响CRH表达　　为了证实下丘脑miR-212对CRH有负性调节作用，在小鼠下丘脑原代细胞及HT-22海马细胞过表达和抑制miR-212，观察CRH的表达变化，结果表明过表达miR-212，CRH表达下降，而抑制miR-212，CRH表达升高。　　（二）双荧光素酶报告基因实验证明mir-212与CRH3’UTR有结合活性　　在上述实验基础上，又使用双荧光素酶报告基因方法检测miR-212与是否能够直接结合CRH3’UTR，结果表明miR-122与CRH的3’-UTR区的结合位点有结合活性。　　（三）miR-212以负前馈形式参与转录因子CREB介导的CRH表达调控　　通过文献了解到，CREB既是miR-212的转录调控因子，同时也是CRH的转录调控因子，为了阐明CREB，miR-212和CRH之间的关系，首先检测了反复热应激和反复束缚应激小鼠下丘脑CREB基因以及CREB、p-CREB蛋白的表达量，结果发现两种应激模型小鼠下丘脑的CREB表达在1，3，7，14天均呈逐步上升的趋势。然后通过HT-22细胞实验发现，过表达CREB可促进mir-212及CRH表达，过表达CREB的同时过表达mir-212可缓解CREB引起的CRH表达升高，而过表达CREB的同时抑制mir-212则可进一步促使CREB引起的CRH表达升高。综合上述实验结果，表明，miR-212是以负前馈形式参与转录因子CREB介导的CRH表达调控。　　三、体内实验证实干预下丘脑miR-212表达可影响反复应激过程中CRH表达与HPA轴活性　　为了进一步在整体水平证实下丘脑miR-212表达变化可影响CRH表达与HPA轴活性，分别在小鼠下丘脑注射miR-212激动剂或抑制剂，观察其对反复应激小鼠下丘脑CRH表达和HPA活性的影响，结果表明，反复应激1天、3天、7天、14天，与同期载体对照组相比，注射miR-212激动剂组小鼠下丘脑内miR-212表达明显升高，CRH表达降低,同时血清ACTH、CORT水平明显降低；而注射miR-212抑制剂组，与同期载体对照组相比，下丘脑内miR-212表达明显降低，CRH表达升高，同时血清ACTH、CORT水平明显升高。另外，无论是下丘脑注射miR-212激动剂组或抑制剂组,与同期载体对照组相比，反复应激小鼠下丘脑的CREB表达均没有明显变化。　　结论：　　一、在反复应激过程中小鼠下丘脑miR-212表达逐渐升高而HPA轴活性先升高后下降；　　二、体外实验证实，miR-212以负前馈形式参与转录因子CREB介导的CRH表达调控；　　三、体内实验证实，人为的改变下丘脑miR-212表达水平可以通过负向调控CRH表达进而影响HPA轴的活性。　　综合上述实验结果，表明，反复应激过程中下丘脑转录调控因子CREB活性逐渐增强，在促进CRH表达升高的同时还促进了miR-212的表达增强，而后者通过负前馈抑制CRH表达，最终将HPA轴的活性维持在一个合适的水平。