第一部分:先天缺牙家系中致病基因的筛查与分子机制研究先天缺牙(congenital tooth agenesis)是人类最常见的发育异常之一,表现为牙齿数目的不足。根据缺牙数目的多少,可分为个别牙缺失(hypodontia,缺牙数目少于6颗)、多数牙缺失(oligodontia,缺牙数目6颗及6颗以上)和先天无牙症(anodontia,全部牙齿缺失)。根据是否合并有全身其他症状,可分为非综合征型先天缺牙(non-syndromic tooth agenesis)和综合征型先天缺牙(syndromic tooth agenesis)。可有散发或者家族遗传形式,后者可以表现为常染色体显性或者隐性遗传、X-连锁遗传。目前,已经证实MSX1、PAX9、AXIN2、EDA、WNT10A等基因突变可以导致非综合征型先天缺牙,EDA、IRF6、PITX2、FGFR1、SHH等基因突变可以导致综合征型先天缺牙。本课题组持续收集先天缺牙家系及散发病例,所有研究已经通过武汉大学伦理委员会审批。在知情同意原则下,每位参与者均签署知情同意书,未满14岁者由其监护人代理。每位参与者均接受口腔及全身检查,诊断最终经曲面断层片确认。目的:收集先天缺牙家系及散发病例,对先证者及其家系成员进行全面的调查和遗传特征分析,筛查致病基因并探讨其致病机制。方法:以先天缺牙患者、家系内正常人及800位无血缘关系的正常人为研究对象,通过对MSX1,PAX9,AX N2,EDA,WNT10A基因的PCR产物直接测序,进行致病基因的筛查。用限制性内切酶检测方法验证在PAX9上发现的新突变。对于突变AXIN2的研究,用定点诱变的方法构建3个AXIN2的突变质粒(pCMV6-HIS-His660Tyr根据本研究新发现的突变AXIN2c.1978C>T构建;pCMV6-HIS-Arg656Stop,pCMV6-HIS-Leu688Stop 分别根据已报道的AXIN2 c.1966C>T,AXIN2 c.1994delG 构建)。将正常与突变质粒分别转染293T细胞系,通过western blot及双萤光素酶报告等方法研究突变对AXIN2功能的影响。结果:在两个无血缘关系的先天缺牙家系中发现了 2个新突变:c.2T>A,位于PAX9的起始密码子;AXIN2c.1978C>T,位于AXIN2的保守区域。对于PAX9突变的研究,应用限制性内切酶检测方法再次证实该突变在家系内的病人中都存在,在正常对照中没有发现。对于AXIN2突变的功能研究,Western blot实验表明,与正常AXIN2相比,突变的p.His660Tyr蛋白在转染细胞中的表达量略有降低,同时导致胞浆、胞核蛋白中β-catenin表达降低,Wnt/β-catenin信号通路被抑制;两个已报道的突变蛋白(p.Arg656Stop、p.Leu688Stop)是截短蛋白,致使胞浆、胞核蛋白中β-catenin水平升高,Wnt/β-catenin信号通路被过度激活。双萤光素酶报告实验显示,p.His660Tyr对荧光素酶的表达有抑制作用,p.Arg656Stop、p.Leu688Stop则明显地促进了荧光素酶的表达,结果与Western blot一致。结论:新突变的发现扩大了 PAX9、AXIN2的突变谱;AXIN2 c.1978C>T通过抑制Wnt/β-catenin信号通路最终导致该中国家系出现非综合征型先天缺牙,AXIN2 c.1966C>T通过过度激活Wnt/β-catenin信号通路最终导致该芬兰家系出现综合征型先天缺牙(同时伴发结肠直肠癌)。通过对突变AXIN2蛋白功能的研究证明不同严重程度的AXIN2基因突变可能对Wnt/β-catenin信号通路以及疾病表型有不同的影响,同时本研究也为Wnt/β-catenin通路的抑制或者过度激活都可能导致先天缺牙的观点提供了功能研究上的佐证。第二部分:TARP在涎腺腺样囊性癌发病机制中的作用涎腺腺样囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma,SACC)是最常见的涎腺恶性肿瘤之一,易复发和远处转移。目前,SACC主要的治疗方法是手术切除联合术后放疗的综合治疗手段,患者的长期预后仍然较差。SACC的生物学机制尚不明确,进一步探讨其发病、进展机理可为疾病提供新的认知和治疗策略。找到参与SACC发生、进展的关键调控因子,对于探索新的诊疗方法以改善病人的预后具有非常大的临床意义。已经被研究的一些因子,如c-Kit,EGFR,HER2等,被认为可能为SACC的分子治疗提供作用靶点。鉴于这些因子的临床应用还不尽如人意,SACC的治疗想要取得突破性进展,我们还需要进一步寻找可能参与SACC发生、进展的调控因子。T-细胞受体γ链改变阅读框架蛋白(T-cell receptor gamma chain alternate reading frame protein,TARP),是一个分子量为7 kDa线粒体外膜蛋白,在良、恶性前列腺肿瘤、乳腺癌、子宫内膜癌中高表达。TARP作为前列腺癌和乳腺癌相关抗原,被认为有望在肿瘤的免疫治疗中为细胞毒性T淋巴细胞和辅助性T淋巴细胞提供作用靶点。然而,目前仍不清楚TARP直接调控的下游基因,TARP在肿瘤发生、进展过程中的具体分子机制仍不明了。到目前为止,尚没有研究探讨过TARP对细胞迁移、侵袭能力的影响,也没有关于TARP在SACC、尤其是SACC转移灶中表达及作用的相关研究报道。目的:探讨TARP在SACC及其转移灶中的表达以及TARP在SACC发生、发展中的作用。方法:应用免疫组化方法探讨50例SACC标本及13例SACC转移灶(11例肺转移、1例肾转移、1例肝转移)中TARP的表达情况;构建TARP稳定过表达细胞系,用增殖、划痕、transwell实验研究TARP过表达对细胞生物学特征的影响。结果:TARP在SACC标本中的表达显著高于正常涎腺组织,SACC转移灶中TARP的表达明显高于原发灶;TARP的表达与肿瘤大小、TNM分期、有无神经浸润、病理类型及是否伴有远处转移有关;与患者的性别、发病时的年龄、肿瘤所在的部位无关。TARP的过表达促进了细胞的增殖、迁移以及侵袭。结论:TARP可能在SACC的发生、发展过程中起重要的作用,并且可能对SACC的发生、发展起提示作用。