家蚕死亡相关的小细胞质富亮氨酸蛋白的表达,定位及其功能初步分析

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家蚕死亡相关小细胞质富亮氨酸蛋白(Bomby.mor.death-associate.smallcytoplasmi.leucine-ric.protein,BmDSCLP)是一种富含亮氨酸重复序列保守结构域的蛋白,是富亮氨酸蛋白超家族的成员之一,据推测其可能在蛋白相互作用,细胞黏附和信号转导等方面发挥重要作用。目前,对死亡相关小细胞质富亮氨酸蛋白的研究只在埃及伊蚊中有报导,而在家蚕中的研究还是空白。   我们通过RT-PCR的方法从家蚕蛹总RNA中扩增到家蚕死亡相关小细胞质富亮氨酸蛋白基因的完整的ORF序列,并将其命名为BmDSCLP(Bomby.morideath-associate.smal.cytoplasmi.leucine-ric.protein),GenBank登录号为DQ675028。该基因ORF长为64.bp,编码213个氨基酸,预测分子量为24.0.kDa。我们将扩增到的BmDSCLP基因克隆到融合表达载体pET-28a(+)相应的酶切位点上,得到融合蛋白表达质粒pET-28a(+)-BmDSCLP,经PCR、酶切鉴定以及测序证明重组子是正确的。将该重组子转化大肠杆菌BL21(DE3),用终浓度为.mM的IPTG诱导重组菌后,裂解菌体作SDS-PAGE分析,在2.kDa上方的位置有一条特异性蛋白条带,与预期值27.6.kDa(融合标签3.5.kDa,BmDSCL.24.0.kDa)相符。融合蛋白以包涵体形式存在,故用超声裂解菌体后1200.rpm离心所得的沉淀经进一步处理后用亲和层析的方法纯化目的蛋白His-ta.BmDSCLP。经FPLC反相柱层析进一步纯化后,再进行质谱分析,得到该融合蛋白的分子量为27740 Da,证实了该蛋白表达的正确性。以纯化所得蛋白为抗原免疫雄性新西兰兔,制备了该重组蛋白的多克隆抗体,ELISA检测该抗血清的效价可达到1:12800以上。用制备的多克隆抗体检测BmDSCLP在BmN细胞中的定位,结果表明该蛋白在细胞质和细胞核中均有分布。另外我们利用荧光定量PCR技术检测家蚕卵、五龄幼虫、蛹、蛾等发育时期以及五龄幼虫各组织中的靶mRNA的表达情况,实验结果表明在发育时期靶mRNA的表达水平由卵到蛾依次升高,而在五龄幼虫中靶mRNA的表达水平由高到低依次为生殖器、头部、表皮、马氏管、气管、脂肪体、中肠和丝腺。上述研究将为进一步探讨BmDSCLP的功能奠定基础。
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