研究背景和目的：美国癌症协会提供的数据显示：结直肠癌发病率和死亡率仍然位居第三。在我国,结直肠癌是第4位最常见的恶性肿瘤,特别是随着经济的发展,人们生活水平的提高,饮食结构的改变,结直肠癌的发病率仍然有提高的趋势。尽管结直肠癌的总预后相对较好,但是晚期远处转移仍旧是结直肠癌死亡的主要原因。因此,如果能充分应用肿瘤分子生物学的研究成果,筛选出一些新颖的分子标记用于结直肠癌的早期筛查,这对于提高结直肠癌的早期诊断阳性率和改善预后结局具有非常重要的临床意义。MicroRNA(miRNA)是一类长度为19-22bp左右大小的小分子RNA,它们能通过与靶基因mRNA 3’UTR碱基特异结合从而形成miRISC(miRNA-associated, multiprotein RNA induced-silencing complex)的方式将其mRNA彻底降解或者抑制其翻译过程,从而抑制靶基因的表达。随着研究的逐步深入,越来越多的证据表明,miRNA在多种肿瘤组织中有异常表达,其广泛参与细胞增殖、迁移、转移及能量代谢过程。同时,如普通基因一样,成熟miRNA也是pre-miRNA由Dicer酶剪切成熟的。Pre-miRNA由基因相应序列转录而成,此过程需要转录因子的参与。特别的,随着血液标本检测miRNA技术的提高,通过对血液中特异miRNA的检测,可以用于肿瘤的临床诊断、预后评估、术后监测及随访!文献报道：miR-520d-5p通过靶向TWIST1抑制乳腺癌的增殖和迁移。另外,miR-520d-3p可以通过靶向EphA2抑制胃癌细胞增殖和迁移、转移。但是,截止目前,尚未有文献报道mi520家族如何在结直肠癌中起作用的研究。因此,我们检测了miR-520d在结直肠癌中的相应表达及其在结直肠癌转移过程中的作用。我们通过基因芯片筛查和Western Blot的方式证实了CTHRC1在结直肠癌中异常高表达,并结合临床病理学资料和生存分析,证实了CTHRC1是结直肠癌预后的一个独立危险因素。已有报道证实CTHRC1通过选择性激活非经典Wnt通路促进肝癌的转移。在癌组织中,CTHRC1可以通过诱导ERK1/2的磷酸化而增强MMP9的表达而促进EMT的发生。通过在相应的生物信息学数据库的检索,我们发现Cthrc1是miR-520d-5p潜在的靶基因。SP1 (Transcription Factor Speciality Protein 1)通过与相应基因上游启动子序列特异性结合,从而激活或者抑制靶基因的转录。SP1广泛参与多种肿瘤的演进过程。Yang WB等证实了SP1通过转录激活miR-182调控肺癌的演进。因此,我们推测miR-520d通过抑制CTHRC1的表达调控结直肠癌细胞的增殖和转移。同时,其接受SPl的转录调控。本研究旨在证实SP1/miR-520d/ CTHRC1的信号机制,并为探讨结直肠癌的增殖和转移提供实验依据。研究方法1.miR-520d-5p在结直肠癌组织和细胞中的表达采用实时荧光定量RT-PCR的方法检测了42对结直肠癌患者及其配对正常肠粘膜上皮中miR-520d-5p的表达。同时检测了SW480、SW620、HT29、LS174T、 LoVo、HCT116、DLD-17株结直肠癌细胞株中miR-520d-5p的表达。2.miR-520d-5p靶基因的筛选和鉴定(1)利用生物信息学相关网站TargetScan、microRNA.org和miRWalk预测miR-520d-5p的靶基因,筛选其候选靶基因。(2)荧光定量RT-PCR检测CTHRC1 mRNA在52对结直肠癌组织和细胞中的相应表达水平。Western Blot检测CTHRC1在组织和细胞中的表达。(3)扩增包括miR-520d-5p结合位点的Cthrc1 3’UTR基因片段,并与pmirGLO双荧光素酶载体连接,同时将Cthrc1 3’UTR片段上的miR-520d-5p结合位点进行定点突变。应用荧光素酶报告系统检测miR-520d-5p与Cthrc1 3’UTR的结合情况,明确Cthrcl是否为niR-520d-5p直接作用的靶基因。3.miR-520d-5p对结直肠癌细胞体内外生物学行为的影响(1)利用慢病毒包装系统,制备稳定过表达miR-520d-5p的病毒上清,并将其转导入LoVo细胞中,建立稳定过表达miR-520d-5p的细胞株。并进行体外细胞增殖、平板克隆、迁移和侵袭实验。(2)将miR-520d-5p的化学合成模拟类似物(mimic)和抑制物(inhibitor)分别转入SW480、SW620、LoVo、HCT116四株结直肠癌细胞中,应用CCK8细胞增殖实验、平板克隆形成实验、Transwell迁移和侵袭实验检测miR-520d-5p过表达和抑制时,其对结直肠癌细胞体外的增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力的影响。(3)应用裸鼠皮下成瘤实验检测miR-520d-5p过表达对体内结直肠癌细胞成瘤能力的影响。4.SP1转录激活miR-520d-5p的证实(1)应用UCS、Ensemble、TFSEARCH、Mapper2.0、Promoter 2.0 Prediction Server等生物信息学网站查找miR-520d-5p启动子上的转录因子及结合位点。(2)荧光定量RT-PCR检测20对结直肠癌组织中SP1的相应表达,并将其与之对应的miR-520d-5p的相对表达进行相关分析。(3)应用靶向针对SP1的siRNA,将其转染进LoVo和SW620细胞中,以qRT-PCR检测当SP1被敲低后miR-520d-5p的相对表达。(4)扩增包含SP1结合位点的niR-520d-5p启动子序列并将其克隆进pmirGLO双荧光素酶报告载体,同时对相应结合位点进行单独突变得到相应的突变载体。先将SP1siRNA转染进HEK293T和LoVo细胞里,24h后再将miR-520d-5p启动子载体转染入HEK293T和LoVo细胞。荧光素酶报告系统检测转录因子SP1对miR-520d-5p舌性的影响。5.miR-520d-5p对结直肠癌EMT的影响及相应信号的探讨将miR-520d-5p的化学合成模拟类似物(mimic)和抑制物(inhibitor)分别转入SW480、SW620、LoVo、HCT116四株结直肠癌细胞中,应用Western Blot检测四株细胞EMT标记和ERK1/2、p-ERK1/2蛋白质的变化。6.统计学分析采用SPSS13.0统计软件进行数据分析。定量的数值用均数±标准差(standard deviation,SD)表示。组织的荧光定量PCR结果ACt的比较采用配对样本t检验(Paired-Sample t text),癌组织中miR-520d-5p的表达与病人临床资料的分析用Fisher’s确切检验,细胞荧光定量PCR结果2-△△Ct值、平板克隆形成实验、Transwell迁移和侵袭实验采用两独立样本t检验(Independent-Samples t test)。组织和细胞中miR-520d-5p和Cthrc1及SP1与miR-520d-5p表达量的相关性,正态分布资料选用Pearson’s相关系数,非正态分布资料选用Spearman相关系数；双荧光素酶活性比较F/R值,方差齐性时采用两独立样本t检验,方差不齐时采用近似t检验。CCK8体外增殖实验采用析因设计的方差分析和单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。研究结果1.MiR-520d-5p在结直肠癌组织和细胞中低表达(1)miR-520d-5p在结直肠癌组织中表达下调荧光定量RT-PCR检测结果显示：在42对结直肠癌患者组织及相应配对正常粘膜上皮中,niR-520d-5p在癌组织的表达明显低于正常粘膜组织(P<0.01)。临床病理分析显示:miR-520d-5p在此42例组织中的表达暂未发现与患者年龄、性别、肿瘤分化程度、肿瘤大小、浆膜浸润、淋巴结转移、远处转移有明显关系(P>0.05,P>0.05,P>0.05,P>0.05,P>0.05,P>0.05,P>0.05,P>0.05)。(2)miR-520d-5p在高转移性潜能的结直肠癌细胞系中的表达下调荧光定量RT-PCR检测结果显示：在SW480、SW620、HCT116、HT29、 LoVo、DLD-1、LS174T七种细胞之间的表达具有统计学差异(F=1651.693,P<0.001)。以SW480作为参照,经Dunnett T3多重比较发现,miR-520d-5p在SW620和Lovo细胞中的表达低于SW480,而miR-520d-5p在HCT116、DLD-1细胞的表达高于SW480 (P=0.007;P<0.001)。因此,miR-520d-5p在高转移潜能的结直肠癌细胞系中的表达下调。2.Cthrcl是miR-520d-5p的靶基因(1)采用miRNA靶基因预测网站(TargetScan、microRNA.org和miRWalk)筛查miR-520d-5p的靶基因,发现Cthrc1是其预测的靶基因。(2)荧光定量RT-PCR和Western Blot检测Cthrcl在结直肠癌组织中的表达,Cthrcl在癌组织的表达上调。相关性分析显示：miR-520d-5p与Cthrc1 mRNA在结直肠癌组织中存在负相关关系(P<0.001,r=-0.555)(3) Western Blot检测miR-520d-5p模拟类似物(mimic)及抑制物(inhibitor)转染入SW480、SW620、LoVo、HCT116四株结直肠癌细胞株后Cthrc1的表达,显示：转染入miR-520d-5p mimic后的SW480、SW620、LoVo细胞中Cthrc1较之NC明显降低；转染入rniR-520d-5p inhibitor的HCT116细胞中Cthrc1较之inhibitor-NC组上调。(4)成功构建Wt Cthrc1 3’UTR和Mut Cthrc13’UTR双荧光素酶报告载体,HEK293T细胞中几乎没有miR-520d-5p,将Wt Cthrc1 3’UTR和Mut Cthrc13’UTR以及miR-520d-5p mimic或者阴性对照(negative control)共转染入SW620、LoVo和HEK293T细胞中。在SW620细胞中,在miR-520d-5p存在的情况下,Wt Cthrc1 3’UTR载体的荧光素活性下调(P<0.05),而Mut Cthrc13’UTR双荧光素活性无明显统计学差异(P>0.05)。在HEK293T和LoVo细胞中,在miR-520d-5p存在的情况下,Wt Cthrc1 3’UTR载体的荧光素活性下调,并随着miR-520d-5p剂量的增加,Wt Cthrc1 3’UTR载体的荧光素活性下调得更加明显,50pmol miR-520d-5p mimic较之20pmol引起更加显著的下调(P<0.01),而Mut Cthrcl 3’UTR双荧光素活性无明显统计学差异(P>0.05)。这表明miR-520d-5p可以与Cthrcl 3’UTR特异性结合。3.miR-520d-5p通过抑制Cthrcl的表达从而抑制结直肠癌细胞体内外的生长和转移(1)以空载体病毒(Control)为对照,在LoVo细胞中感染miR-50d-5p病毒,建立miR-520d-5p稳定过表达LoVo细胞亚系。与Control组比较,miR-520d-5p在LoVo/miR-520d-5p组细胞中表达升高(P<0.01)。Western Blot证实与对照Control组比较,Cthrcl在LoVo/miR-520d-5p细胞中表达降低。(2)荧光定量RT-PCR和Western Blot检测显示：应用miR-520d-5p mimic和inhibitor转染进SW480、SW620、LoVo和HCT116细胞后,与阴性对照NC组相比,在SW480、SW620、LoVo细胞mimic组细胞中,miR-520d-5p表达上调(P<0.01；P<0.01；P<0.01),同时Cthrcl的表达较之NC组明显降低。在HCT116细胞中,miR-520d-5p inhibitor较之inhibitor NC,miR-520d-5p表达下调(P<0.01),同时Cthrcl表达升高。(3)与Vector相比,稳定过表达miR-520d-5p抑制LoVo/miR-520d-5p细胞的增殖能力(P<0.01),克隆形成能力(P<0.01),迁移(P<0.01)和侵袭能力(P<0.01)。(4)CCK-8细胞增殖实验显示：较之NC组,SW480/mimic、SW620/mimic、 LoVo/mimic细胞增殖能力明显降低(P<0.01；P<0.01；P<0.01)；HCT116/inhibitor较之inhibitor NC细胞增殖显著增强(P<0.01)。(5)平板克隆形成实验表明：较之NC组,SW480/mimi、SW620/mimic、 LoVo/mimic细胞克隆形成能力明显降低(P<0.01；P<0.01；P<0.01)；HCT116/inhibitor较之inhibitor NC细胞克隆能力显著增强(P<0.05)。(6)Transwell迁移实验表明：较之NC组,SW480/mimic、SW620/mimic、 LoVo/mimic细胞迁移能力明显降低(P<0.01；P<0.01；P<0.01)；HCT116/inhibitor较之inhibitor NC细胞迁移能力显著增强(P<0.01),Transwell侵袭实验结果类似。(7)裸鼠皮下成瘤实验表明：LoVo/miR-520d-5p较之LoVo/vector组皮下瘤体积明显降低(P<0.05)。皮下瘤行荧光定量RT-PCR和Western Blot表明：较之LoVo/vector, miR-520d-5p在LoVo/miR-520d-5p组表达明显上调(P<0.05),同时,Cthrcl表达下调。皮下瘤免疫组化表明：Ki-67在LoVo/miR-520d-5p组的表达较LoVo/vector下调。4.SP1转录激活miR-520d-5p(1)通过应用UCSC、Ensemble、TFSEARCH、Mapper2.0、Promoter 2.0 Prediction Server等生物信息学网站筛查,发现SP1可以与1niR-520d-5p上游启动子序列结合,是miR-520d-5p潜在的转录因子。(2)荧光定量RT-PCR检测SP1在20对结直肠癌组织的表达,显示SP1在结直肠癌组织里明显低表达(P<0.01),并与同一标本的miR-520d-5p进行表达相关性分析,显示：SP1与miR-520d-5p在结直肠癌组织里存在明显正相关关系(P<0.01)。(3)应用靶向针对SP1的siRNA转染进LoVo和SW620细胞后,经Western Blot证实SP1已被敲低后,以荧光定量RT-PCR检测其niR-520d-5p表达量较之阴性对照NC组明显降低(P<0.01；P<0.05)。(4)扩增包含SP1结合位点的miR-520d-5p启动子序列并将其克隆进pmirGLO双荧光素酶报告载体pmirGLO-Wt,同时对相应结合位点进行单独突变得到相应的突变载体pmirGLO-MutA、pmirGLO-MutB和pmirGLO-MutC。先将SP1 siRNA转染进HEK293T和LoVo细胞里,24h后再将miR-520d-5p启动子载体转染入HEK293T和LoVo细胞。荧光素酶报告系统检测转录因子SP1对miR-520d-5p活性的影响。结果显示：5种荧光素酶报告载体在HEK293T和LoVo细胞中有显著差异(P<0.01；P<0.01)。在HEK293T细胞中,与对照pmirGLO-Basic相比,SP1 siRNA可以降低pmirGLO-Wt、pmirGLO-MutA和pmirGLO-MutB的荧光素酶活性(P<0.01；P<0.01；P<0.01),而不改变pmirGLO-MutC的荧光素酶活性(P>0.05)。在LoVo细胞中,与对照pmirGLO-Basic相比,SP1 siRNA可以降低pmirGLO-Wt、pmirGLO-MutA和pmirGLO-MutB的荧光素酶活性(P<0.01；P<0.01；P<0.05),而不改变pmirGLO-MutC的荧光素酶活性(P>0.05)。以上实验表明：在结直肠癌中,SP1可以转录激活mR-520d-5p的表达。5.miR-520d-5p调控结直肠癌信号通路的探讨(1) Western Blot结果显示：和NC组相比,p-ERK1/2在SW480、SW620和LoVo miR-520d-5p mimic处理组中的活性下降,而总蛋白量T-ERK1/2在各细胞两处理组间无显著差异。随之EMT标记：E-cdherin上调,N-cadherin和vimentin下调。(2) Western Blot结果显示：和inhibitor NC组相比,p-ERKl/2在HCT116miR-520d-5p inhibitor处理组中的活性上调,而总蛋白量T-ERK1/2在细胞两处理组间无显著差异。随之EMT标记：E-cdherin下调,N-cadherin和vimentin上调。以上结果表明：miR-520d-5p可以抑制p-ERK1/2的活性,从而抑制EMT的发生。即miR-520d-5p通过抑制Cthrc1抑制结直肠癌的转移。结论1.miR-520d-5p在结直肠癌组织中表达下调；miR-520d-5p在具有高转移潜能的结直肠癌细胞中表达下调。2.Cthrcl是miR-520d-5p的直接靶基因,miR-520d-5p通过抑制Cthrc1进而抑制结直肠癌细胞的生长和转移。3.SP1通过与miR-520d-5p上游启动子序列结合进而转录激活miR-520d-5p的表达。4.miR-520d-5p抑制p-ERK1/2的活性进而抑制结直肠癌细胞的EMT进程。