目的：通过动物及体外细胞汞中毒模型,探讨土茯苓解汞毒的药效特点、作用机制及其物质基础,为土茯苓解汞毒药理活性提供研究基础和科学依据。方法：研究一：土茯苓解汞毒作用机制及其有效部位初步研究采用溶剂法将土茯苓水煎液分为总提液(水煎液)、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位；利用皮下注射HgCl2(2.5mg·kg-1)造成急性汞中毒大鼠模型,以土茯苓水煎液及其各萃取部位进行灌胃给药,初步探讨土茯苓解汞毒活性,筛选土茯苓解汞毒有效部位；结合筛选实验,制备土茯苓解汞毒有效部位,观察其对HgCl2中毒大鼠氧化应激损伤的影响。研究二：土茯苓解汞毒部位的谱效结合研究收集若干批土茯苓,制备土茯苓解汞毒有效部位；以L02细胞为研究对象,采用MTT法筛选HgCl2诱导肝细胞损伤的适宜浓度及各批土茯苓解汞毒有效部位进行干预的最适浓度；采用倒置显微镜观察空白组、模型组、给药组细胞形态,并检测各组细胞活性；采用酶标仪-试剂盒法检测各组细胞上清液中谷草转氨酶(ALT)、谷丙转氨酶(AST)泄漏量。采用高效液相色谱法,建立土茯苓解汞毒部位指纹图谱；采用紫外-可见分光光度法对土茯苓解汞毒部位中总黄酮的含量进行测定；采用高效液相色谱法测定解汞毒部位中落新妇苷、花旗松素、白藜芦醇、柚皮素、黄杞苷、咖啡酸的含量；综合利用相关性等分析方法结合细胞试验结果,探讨土茯苓解汞毒部位HPLC指纹图谱、总黄酮及活性成分含量与其解汞毒活性的相关性。研究三：土茯苓解汞毒部位纯化工艺初步研究结合谱效相关性分析结果,综合利用紫外-可见分光光度法、高效液相色谱法、大孔树脂纯化等方法及技术,优选土茯苓解汞毒部位最佳纯化工艺。结果：1初步探明土茯苓解汞毒作用机制及其有效部位1.1汞含量及相关指标检测结果显示,与空白组相比,HgCl2中毒模型组大鼠肝、肾皮质及尿汞含量和血清尿素氮含量,尿蛋白、LDH以及ALP活力都明显升高,差异具有统计学意义(p<0.01),肾病理组织学观察结果显示,肾组织出现严重病变,说明汞在大鼠体内过度蓄积并造成了严重的肾功能损伤；土茯苓总提液及乙酸乙酯部位组均能不同程度降低染汞模型组大鼠血清尿素氮以及肝肾两脏汞含量,促进汞离子通过尿液排出,并降低尿蛋白及LDH、ALP活力,与模型组相比,总提液高、中剂量组(折合生药量1、2g/mL),乙酸乙酯部位组(折合生药量1g/mL)各指标均有统计学意义(p<0.01或p<0.05)；肾脏病理组织学观察结果显示,土茯苓高剂量组干预下的汞中毒大鼠肾组织出现良性恢复,肾小管形态趋于正常,肾小球萎缩状况明显改善。1.2土茯苓解汞毒部位对HgCl2中毒大鼠氧化损伤保护机制研究结果显示,与空白组相比,模型组大鼠肝及肾氧化应激产物GSH、CAT、SOD含量明显降低,MDA含量明显增加,差异具有统计学意义(p<0.01)；与染汞模型组相比,药物1g/mL及2g/mL剂量组可较为明显的增加汞中毒大鼠肝及肾脏GSH、CAT、SOD含量,并减少MDA含量,差异具有统计学意义(p<0.01或p<0.05)。2土茯苓解汞毒部位的谱效结合研究2.1土茯苓解汞毒部位对HgCl2诱导的肝细胞损伤的保护作用2.2.1制备土茯苓解汞毒部位：收集得到11批土茯苓药材,经鉴定后按制备方法制备得11批解汞毒部位。2.2.2HgCl2及土茯苓解汞毒部位对L02细胞的影响：随着HgCl2浓度不断增大细胞存活率逐渐下降,并且随着时间延长,细胞存活率下降越明显。结合文献报道,本研究采用细胞存活率在50%以上的HgCl2作为体外HgCl2中毒模型的诱导剂,即浓度为3.0μmol/L的HgCl2作用24小时；各批土茯苓解汞毒部位体现了低细胞毒性的特点,在作用36小时内,浓度低于250μg/mL时,细胞存活率下降较低,可视为土茯苓解汞毒部位的安全给药浓度。2.2.3土茯苓解汞毒部位对HgCl2诱导的L02细胞损伤的保护作用：HgCl2作用24小时结果显示,与空白对照组细胞相比,模型组细胞的AST、ALT含量明显增加,差异具有统计学意义(p<0.01)；与模型组细胞相比,药物组细胞AST、ALT有不同程度减少,其中,除T3各剂量组及部分样品低剂量组无统计学意义外(p>0.05),其它各批药物的高、中剂量组均具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)；细胞活性实验结果显示,各批土茯苓解汞毒部位解毒效果差异较大,其中,与模型组细胞相比,T1、T2、T4、T7、T10、T11药物各剂量组均具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)；T6、T8、T9药物高、中剂量组具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)；T5药物仅高剂量组具有统计学意义(P<0.01)；T3药物各剂量均无统计学意义。2.2土茯苓解汞毒部位的谱效关系研究2.2.1土茯苓解汞毒部位指纹图谱的建立：通过对各HPLC图谱匹配分析,共确定16个共有峰,其中确定已知成分为落新妇苷、咖啡酸、黄杞苷、花旗松素、白藜芦醇、柚皮素；11批土茯苓解汞毒部位HPLC指纹图谱与对照图谱的相似度在0.753～0.991之间,其中,T3样品相似度最低。2.2.2土茯苓解汞毒部位活性成分含量测定研究结果：总黄酮测定结果显示,11批土茯苓解汞毒部位中总黄酮含量差异性显著(P<0.05),百分含量在21.30%～30.95%之间,其中产地为广东的T1样品总黄酮含量最高,产地为广西的T3样品总黄酮含量最低；单个成分含量测定结果显示,11批土茯苓解汞毒部位样品间落新妇苷、花旗松素、白藜芦醇、黄杞苷、咖啡酸、柚皮素的含量有显著性差异(P<0.05)。落新妇苷含量2.43%～3.65%之间；花旗松素在1.16%～1.52%之间；白藜芦醇含量在1.79-2.10%之间,黄杞苷含量在1.95%-2.47%之间；咖啡酸含量在0.44%-0.65%之间；柚皮素含量在0.81%-1.15%之间,其中T3样品的各项含量均较低。2.2.3相关性分析结果：土茯苓解汞毒部位中总黄酮、落新妇苷、白藜芦醇、黄杞苷、咖啡酸含量与HgCl2中毒细胞存活率有显著正相关性(P<0.01)；解汞毒部位中总黄酮含量,落新妇苷、花旗松素、白藜芦醇、黄杞苷、咖啡酸、柚皮素含量与AST泄漏量呈负相关,相关性分别为-0.88、-0.901、-0.948、-0.814、-0.691、-0.916、-0.852；解汞毒部位HPLC指纹图谱中,8个共有峰与解汞毒活性有显著的相关性(P<0.05或P<0.01),其中已知成分有咖啡酸、落新妇苷、白藜芦醇、黄杞苷。3土茯苓解汞毒部位纯化工艺参数的确定最佳工艺参数为：ADS-7大孔吸附树脂、上样液浓度1mg/mL, pH5.0,最大上样量每mL树脂0.75mmg母液,最佳上样流速5BV.h-1,用8BV70%乙醇,2mL/min的速度洗脱。在此条件下,以T1样品为例,纯化后的解汞毒部位产物中总黄酮纯度达40.03%;落新妇苷、白藜芦醇、黄杞苷、咖啡酸含量分别提高到4.23%、2.54%、2.56%、0.87%。结论：1土茯苓解汞毒有效部位及其作用机制从体内试验层面证实了土茯苓解汞毒应用的有效性及合理性,并锁定了以土茯苓水煎液为基础的乙酸乙酯萃取部位是土茯苓发挥解汞毒活性的有效部位；土茯苓的解汞毒作用可能与其利尿、抗氧化应激损伤及保护肝肾功能的综合作用有关。2土茯苓解汞毒部位的谱效结合研究2.1土茯苓对HgCl2诱导的肝细胞损伤保护作用以L02细胞为研究对象,证实了土茯苓体内解汞毒部位在体外实验中的有效性,实验结果表明,土茯苓乙酸乙酯部位可明显提高HgCl2中毒细胞的成活率；对于HgCl2引发的细胞毒性及AST、ALT指标有一定的降低作用。提示土茯苓乙酸乙酯部位对HgCl2诱导的L02细胞损伤具有一定的保护作用,这种保护作用随土茯苓来源及产地的不同而显现一定的差异性。2.2土茯苓解汞毒部位的谱效关系分析相关性及谱效关系研究结果显示,有效部位中总黄酮及落新妇苷、白藜芦醇、黄杞苷、咖啡酸对土茯苓解汞毒活性呈现较为明显的正相关性,即相应成分含量越高,保护作用越强,推测总黄酮及落新妇苷、白藜芦醇、黄杞苷、咖啡酸可能是土茯苓发挥解汞毒活性的主要物质基础。3土茯苓解汞毒部位纯化工艺研究通过对ADS-7大孔吸附树脂纯化土茯苓解汞毒活性部位研究,确定了该树脂的最佳工艺参数。在此工艺条件下,有效部位产物中总黄酮纯度落新妇苷、白藜芦醇、黄杞苷、咖啡酸相对含量均有不同程度提高,可为土茯苓解汞毒药物开发提供参考依据。