论文部分内容阅读
目的通过检测狼疮性肾炎(lupusnephritis,LN)患者血清中哇巴因浓度水平,探讨哇巴因对肾小管上皮细胞的损伤作用及可能机制,从而为狼疮性肾炎提供新的治疗靶点。方法1.分别收集20名健康对照和21名LN患者血清标本,采用ELISA法检测内源性哇巴因(endogenous ouabain,EO)含量;2.分别收集正常肾脏组织(来源于肾肿瘤切除中的正常组织)和LN患者的肾活检组织,应用免疫组化方法检测两组标本中钠钾ATP酶α1(Na/K-ATPase α1,NKAα1)表达及分布情况;3.不同浓度哇巴因刺激HK-2细胞于不同时间点后,应用MTT法检测细胞的增殖,通过Annexin V FITC/PI双染流式细胞术检测HK-2细胞凋亡率,细胞免疫荧光检测 HK-2 细胞 NKA α 1 表达,Western blot 检测 NKA α 1、p-Src/Src、p-ERK/ERK、p-Akt(473)/Akt、p-S6K/S6K、Caspase3 表达;4.HK-2 细胞用 Src 激酶抑制剂-PP2(1 uM)或mTOR抑制剂-雷帕霉素(10 ug/1)预处理1小时,加入100 nM哇巴因孵育30 min、1 h、24 h,应用Annexin V FITC/PI双染流式细胞术检测HK-2细胞凋亡率变化,Western blot 检测 p-Src/Src、p-ERK/ERK、p-Akt/Akt、p-S6K/S6K、Caspase3表达变化。结果1.LN患者血清中EO含量较健康对照者明显增加(P<0.001);2.LN患者肾小管NKA α 1表达明显减少;3.哇巴因以剂量和时间依赖方式诱导HK-2细胞凋亡;4.随哇巴因刺激浓度和时间增加,NKAα1表达先增加,然后减少;4.随哇巴因浓度增加和时间延长,p-Src、p-ERK、p-Akt、p-S6K、Caspase3表达上调;5.PP2、雷帕霉素预处理HK-2细胞可逆转其下游信号分子的活化,并抑制细胞凋亡。结论1.哇巴因在LN患者体内含量增加;2.哇巴因通过NKA/Src/ERK/Akt/mTOR信号诱导肾小管上皮细胞凋亡。