β-羟基脂肪酸是一类具有重要活性的化合物,在天然产物合成、药物研发和生物材料领域都有着广泛的应用。利用可再生的脂肪酸一步氧化生成β-羟基脂肪酸是一种理想、直接且经济的制备方法。但如何在含有多个C-H基团的脂肪酸中对β位点实施氧化,在化学和生物体外合成都极具挑战性,且尚未实现。过氧化物酶P450Bsβ可以利用过氧化氢以自然界中广泛存在的脂肪酸为底物催化生成α-和β-羟基脂肪酸,同时伴随一定量的1-烯烃产生,因此P450Bsβ是一个区域选择性差的酶。而且P450Bsβ的底物特异性很高,仅能较好的催化碳链长度大于10的脂肪酸,对短链脂肪酸基本没有催化能力。所以提高P450Bsβ的区域选择性和拓宽底物范围,发展一种以脂肪酸为底物直接生成β-羟基化脂肪酸的生物合成方法具有重大的理论和应用意义。我们实验室近期对P450BSβ催化脂肪酸脱羧生成1-烯烃的研究中,发现P450Bsβ蛋白能够经过定向进化改造拓宽底物范围和提高区域选择性。在该实验结果的基础上,本论文希望对P450BSβ蛋白继续进行定向进化筛选得到可以专一、有效催化β-羟基短链脂肪酸的突变体。首先我们基于P450BSβ脱羧酶突变体良好的底物范围,直接在该突变体的基础上对影响P450BSβ羟基化的位点进行组合饱和突变筛选,希望将P450Bsβ脱羧酶突变体改造成较专一生成β-羟基脂肪酸的突变体。但是在进行了多轮的筛选后,始终无法解决抑制1-烯烃的问题。于是,我们改变了定向进化策略,以野生型P450BSβ为母本重新筛选既能够接受C6脂肪酸又可以专一生成β-羟基脂肪酸的突变体,我们选取了 P450BSβ-棕榈酸复合物结构中底物C1-C8 8 A范围内的可能影响P450BSβ羟基化的潜在位点,对它们的逐一饱和突变筛选中发现V74、L78、Q85、V170和G290这五个位点能够提高该酶β-羟基化的选择性,然后对它们进行了逐轮的饱和突变筛选,并最终获得了 P450BSβ-L78I/Q85H/G290I突变体。可以催化C5-C18链长的饱和和不饱和的天然脂肪酸以及带各种官能团的非天然脂肪酸底物,且大部分底物的转化率都在90%以上,β-羟基化的选择性在75%以上。本研究成功拓宽了 P450BSβ的羟基化底物范围,为P450BSβ在合成方面的应用奠定基础。