研究背景双链的小分子干扰RNA通过抑制特异性mRNA的转录所引起的基因沉默,被称作是RNA干扰(RNAi),而且RNA干扰技术已经使用了很长的一段时间。小分子干扰RNA已经引起了广泛的关注,因为它在多种疾病中有着非常有前景的治疗效果,例如神经系统疾病,传染病和各种癌症。但是,小分子干扰RNA技术在应用到临床环境之前仍然面临着一系列的障碍,这些障碍主要与以下问题相关,例如：由于血清中酶的降解而导致的很差的药代动力学特征；细胞摄取率低；快速消除和没有靶向特定的细胞类型的能力。因此,设计出能够有效的运载特异性的siRNA到靶组织的载体仍然是一个巨大的挑战,同时也是许多研究的热点。如今,有许多可以自组装形成超分子复合物的非病毒载体已经被设计用来递送小分子干扰RNA。例如,脂质体,脂质体复合物,稳定的核酸-脂质颗粒,阳离子聚合物和肽类等已经被利用来保护小分子干扰RNA,以避免其在转运过程中被不必要的降解。而且,这些载体可以被不同的靶向性配体所修饰从而提高它们的组织靶向能力,这些配体包括：精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD肽),叶酸,转体和抗体。RGD肽及其结构相关的化合物是研究最多的配体,它们属于整合素配体家族。因为这些配体特异性的结合于整合素受体,而这些受体又在肿瘤新生血管的内皮细胞中高表达,其中整合素αvβ3受体在血管的生成和肿瘤的转移中发挥着非常重要的作用,并且在肿瘤血管和各种侵袭性肿瘤细胞中,整合素αvβ3受体的表达都明显升高,但在正常的静止期内皮细胞和组织中表达量比较低,几乎不表达。大量的研究发现与肿瘤相关的整合素αvβ3受体和RGD肽具有高度的亲和力。当在体内使用时,我们发现以环肽c(RGDfk)为基础的,特性性地靶向于整合素αvβ3受体的小分子(RPM)载体可以介导小分子干扰RNA聚集在肿瘤部位,从而发挥肿瘤的靶向治疗作用。抑制新生血管的形成,可以阻断肿瘤的营养供应和产生废物的排出,从而导致肿瘤的生长、侵袭和转移都受到抑制,这种方法已经被广泛地使用于抗肿瘤的研究中。血管内皮生长因子(VEGF),也称作血管通透性因子,在血管的形成中发挥着非常重要的作用,其可以特异性的结合血管内皮生长因子受体2(VEGFR2,也称作KDR/Flk-1,一种酪氨酸激酶受体),然后激活下游信号通路,导致血管内皮细胞迁移和增殖,从而促进新生血管生成和血管生长。因此,抑制血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)在新生血管中的表达是肿瘤治疗的一种有效方法。在这篇研究中,RPM被发现可以自组装形成纳米粒,并可以被用于有效的小分子干扰RNA转运。我们研究了这种携带了siRNA的纳米复合物的各种特征,而且在体外和体内都证明了RPM/VEGFR2-siRNA纳米复合物的基因沉默功能。我们获得了两个水平的靶向性：通过配体c(RGDfk)环肽靶向性地结合在新生血管中高表达的整合素αvβ3受体；通过小分子干扰RNA寡核苷酸实现基因通路上的选择性。具我们所知,这是第一个展示了含环肽c(RGDfk)的小分子化合物RPM具有自组装的能力并且可以有效的运载小分子干扰RNA到达靶组织部位的研究。目的1.制备RPM/siRNA纳米复合物,并研究其表征和特性。2.体外研究RPM/siRNA纳米复合物的细胞靶向性,细胞内的分布,细胞毒性和基因沉默功能。3.体内研究RPM/siRNA纳米复合物抑制斑马鱼血管生成的作用。4.体内研究RPM/siRNA纳米复合物肿瘤组织的靶向性：经尾静脉系统给药后,在不同时间点,观察纳米复合物所携带的Cy5荧光标记的siRNA在荷瘤裸鼠体内的动态分布和肿瘤靶向性。5.RPM/siRNA纳米复合物抑制肿瘤生长的功能及其机制研究：研究经尾静脉系统途径给予RPM/siRNA纳米复合物后抑制肿瘤生长的生物学功能,及其作用机制(抑制血管生成、导致基因沉默)；同时通过对免疫因子和血液化学成分的检测来评价体内给予RPM/siRNA纳米复合物后的安全性。方法1.RPM/siRNA纳米复合物的制备,以及纳米复合物的表征和特性的研究RPM的合成和纯化由美国PEPTIDES INTERNATIONAL公司完成,将RPM溶液与小分子干扰RNA溶液混合孵育即得到RPM/siRNA纳米复合物。使用投射电镜来观察纳米复合物的形态,电荷和粒径分析仪来检测纳米复合物的带电情况和粒径大小,并使用元二色谱来探索RPM分子在形成纳米复合物时的二级结构。同时,研究了RPM/siRNA纳米复合物在血清中的稳定性。2.RPM/siRNA纳米复合物体外功能的研究使用共聚焦显微镜来检测标记了Cy5的siRNA分子在细胞内的分布情况,从而验证RPM/siRNA纳米复合物能靶向性地进入到表达整合素αvβ3受体的细胞中。通过对Cy5荧光的识别,采用流式细胞分析技术,检测不同比例的RPM与siRNA-Cy5混合后所形成的纳米复合物介导siRNA进入细胞内的量,从而取得最佳使用配比。采用CCK-8检测试剂盒来评价RPM/siRNA纳米复合物的体外细胞毒性。为了评价RPM/siRNA纳米复合物在体外细胞中的基因沉默功能,分别采用RT-qPCR和western blot技术从mRNA和蛋白水平来验证。用One-Way ANOVA进行统计学分析；根据方差是否齐性选择LSD或者Dunnett T3检验,比较各组之间的差异。3.RPM/siRNA纳米复合物抑制斑马鱼血管生成的研究本研究选用flk-1:GFP转基因的斑马鱼和野生型的斑马鱼作为模型生物。在显微镜下挑选出发育良好的斑马鱼胚胎(10hpf),放入6孔板中,每孔为20个。通过显微注射分别将RPM/siRNA纳米复合物(zVEGFR2,2 nl), RPM/ ControlsiRNA纳米复合物(2nl),裸的siRNA (zVEGFR2,2 nl)或ddH20 (2nl)注射进10hpf的斑马鱼胚胎。然后置于28.5℃孵育,在72hpf时,采用共聚焦显微镜观察各组斑马鱼血管的发育状况。采用相对荧光强度对斑马鱼血管发育的情况进行定量分析。以Adobe Photoshop 7.0软件记录多层扫描投射荧光集合(Z-stack Projection).:以灰度平均值记为荧光亮度,结果以各组荧光亮度与对照组之比进行统计分析。相对荧光强度以ddH20处理组为空白对照组。4. RPM/siRNA-Cy5纳米复合物在体内对肿瘤组织的靶向性和分布研究RPM/siRNA-Cy5纳米粒复合物,裸的siRNA-Cy5分子以及生理盐水经尾静脉给药后,使用小动物活体成像系统IVIS Spectrum (Xenogen)检测Cy5标记的siRNA在荷瘤裸鼠体内的分布。当裸鼠的肿瘤体积达到约50mm3时,首先用底物D-Luciferin对肿瘤(A549-luc+细胞,表达luciferase)进行生物发光定位,然后给予RPM/siRNA-Cy5纳米复合物(含lnmol Cy5标记siRNA分子),Cy5标记的裸siRNA分子(lnmol),随后在不同的时间点,使用小动物活体成像仪检测Cy5标记siRNA分子在荷瘤裸鼠体内的分布情况并成像。24h后,过量麻醉处死小鼠,取出肿瘤以及各个主要器官进行成像分析。5. RPM/siRNA纳米复合物抑制肿瘤生长的功能及其机制研究在裸鼠右肩皮下接种约5×106个A549-luc+细胞,即用荧光素酶标记的A549细胞(人非小细胞肺癌细胞)来建立肿瘤模型。使用游标卡尺来测量肿瘤体积,计算公式为1/2×ab2(a代表肿瘤长直径,b代表肿瘤短直径)。当肿瘤体积到达40-60mm3,随机将荷瘤裸鼠分为三组。每组裸鼠尾分别静脉注射给予100μl的生理盐水,100μl的RPM/siVEGFR2纳米粒(RPM:60μl,5mg/ml; siVEGFR2: 40μl,50μM)和100μl的RPM/ControlsiRNA纳米粒(RPM:6μl,5mg/ml; ControlsiRNA:40μl,50μM).每三天给药一次,共给药6次。裸鼠的肿瘤体积以及体重在每次给药前进行测定。并在第0天和第20天时,腹腔给予底物D-Luciferin,使用小动物活体成像系统IVIS Spectrum (Xenogen)检测肿瘤细胞的生物发光强度并成像。使用单因素重复测量方差分析比较给药各组肿瘤体积是否具有统计学差异,并绘制肿瘤生长曲线比较各组肿瘤生长是否存在差异。在分别给药6和24h以后,用水合氯醛麻醉小鼠,眼球采血,分离血清,通过ELISA检测试剂盒检测细胞因子IFN-α, IFN-γ, IL-6和IL-12的表达。在最后一次给药以后,采集血清并使用全自动血液分析仪检测血清中ALT和Cr含量以评价肝肾毒性。同时,剥离肿瘤组织,拍照后立即投入液氮保存,以备用于RNA及蛋白提取分析。用免疫组化方法检测肿瘤组织切片中CD31的表达量以判断血管生长状况。用One Way ANOVA对数据进行统计分析。结果1. RPM/siRNA纳米复合物的表征和特性本课题通过简单的方法制备了RPM/siRNA纳米复合物,纳米复合物的形成机制如图1-1所示,并对其表征和特性进行了研究：投射电镜结果显示,RPM/siRNA纳米复合物呈圆球形,而且粒径小于100nm；电位和粒度分析仪测得RPM/siRNA纳米复合物的粒径范围为105.7nm-141.8nm,且粒径分布范围较窄。其zeta电位为负电性,为-6.16 mV。元二色谱显示RPM/siRNA纳米复合物的二级结构组成为β折叠和自由卷曲,其中β折叠占主要部分。血清稳定性试验显示,RPM/ siRNA纳米复合物中的siRNA分子的降解明显比裸的siRNA分子缓慢,在12个小时时仍有部分未降解。2. RPM/siRNA纳米复合物的体外功能(1)共聚焦显微镜的结果显示在转染RPM/siRNA-Cy5纳米复合物6h以后,HUVEC细胞和A549细胞的胞质中都存在大量Cy5荧光信号,而在用整合素αvβ3特异性抗体封闭以后再转染的HUVEC细胞中则无Cy5荧光信号出现,同时阴性肽对照组RAPM/siRNA-cy5也没有信号进入至IJHUVEC细胞中。流式细胞检测结果显示不同量的RPM和同样量的siRNA-Cy5分子混合后转染进入HUVEC细胞中的siRNA-Cy5分子的量不同,荧光强度达到最大时,RPM和siRNA-Cy5分子的体积比为1.5：1.(2)处理后的细胞在37℃孵育24小时以后,用试剂盒测得细胞的活性在RPM组,RPM/siRNA纳米复合物组和未处理组之间无显著性差异(P>0.05),而阳性对照(Lipofectamine 2000)/siRNA复合物组细胞的相对活性约为50%,跟其他组相比均有显著性差异P<0.05)。(3)RT-qPCR结果显示在转染48小时以后,RPM/siRNA纳米复合物转染组和阳离子脂质体转染组(Lipo2000/siRNA)靶基因mRNA的表达量分别为～38%和～39%,二者间无统计学差异(P>0.05),但两组与未处理组以及阴性对照组相比均有显著性差异(P<0.05)；Western blot结果表明,在转染48小时以后,两组靶蛋白的表达率分别为～29%和～36%,二者间无统计学差异(P>0.05),但两组与未处理组以及阴性对照组相比均有显著性差异(P<0.05)。3. RPM/siRNA纳米复合物抑制斑马鱼血管生成在72 hpf时,我们通过激光共聚焦显微镜观察了RPM/siRNA纳米复合物对斑马鱼躯干部位血管生成的影响。躯干部的血管相对于头面部血管更加简单和规则,也更便于比较,当前对这些血管的研究也比较透彻,故选择这一区域进行观察。斑马鱼胚胎中αvβ3受体在48hpf开始表达,而斑马鱼胚胎发育中主要的背纵向血管(dlavs)和节间血管(ISVs)在24hpf完全发育。而新生血管主要在24hpf和72hpf之间发育,因此我们选择在72hpf时用共聚显微镜观察。与使用ddH20处理组的斑马鱼相比,给予了RPM/siRNA纳米复合物组的斑马鱼新生血管的发育明显受到抑制,其相对荧光强度的表达量约为51.4%,两组之间具有显著差异(P<0.05)。4. RPM/siRNA-Cy5纳米复合物在体内对肿瘤组织的靶向性和分布经尾静脉注射给予RPM/siRNA-Cy5纳米复合物,裸的siRNA-Cy5分子以及生理盐水后10min到24h的不同时间点,通过小动物活体成像仪观察得到：在注射0.5h时,便可看到RPM/siRNA-Cy5组荧光明显开始聚集于肿瘤部位,而且这种聚集随着时间的延长一直增加；而裸的siRNA-Cy5分子组随着时间的流逝并没有在肿瘤部位检测到荧光,其荧光主要聚集在肾脏和肝脏。经解剖后,裸鼠的各个主要器官和肿瘤组织成像的结果与活体成像的结果相符合。5.RPM/siRNA纳米复合物抑制肿瘤生长的功能和作用机制(1)每三天一次经尾静脉注射给予荷瘤裸鼠RPM／siRNA(siVEGFR2),RPM／ ControlsiRNA和生理盐水,共6次。在不同的时间分别测定每组肿瘤的体积和肿瘤细胞的荧光强度。距离第一次给药后20天测量得到：生理盐水组和RPM/ Control siRNA组裸鼠的肿瘤明显增大,而与这两组相比,RPM/siRNA(siVEGFR2)组的肿瘤生长明显受到了抑制,具有显著性差异(P<0.05)。同时,肿瘤生物发光的强度的降低也只出现在RPM/siRNA(siVEGFR2)组。而且三组之间荷瘤裸鼠的体重没有显著性差异。(2)RT-qPCR结果显示,目的基因VEGFR2的mRNA表达水平在RPM/siRNA (siVEGFR2)组明显降低,约为23%,与其他两组相比具有显著性差异(p=0.000 <0.05).western blot结果显示,目的基因VEGFR2的蛋白表达量也是在RPM/ siRNA(siVEGFR2)组明显降低,表达量约为43%,与其他两组相比具有显著性差异(P=0.000<0.05).(3)肿瘤切片免疫组化分析(CD31染色)的结果显示：与对照组RPM/ ControlsiRNA和生理盐水相比,由于VEGFR2基因的表达降低,RPM/siRNA (siVEGFR2)组中的血管密度也明显降低。ELISA检测结果显示：在给药后6h和24h时,与对照组相比,RPM/siRNA(siVEGFR2)组小鼠血清中的细胞因子IL-6,IL-12,IFN-α和IFN-γ,并没有表达量明显升高的表现,三组之间无显著性差异(P>0.05)。此外,在血清中肌酐和丙氨酸转氨酶的表达量的检测中,RPM /siRNA(siVEGFR2)组的表达也无异常,三组之间无显著性差异(P>0.05)。同时,在整个给药过程中,并没有发现有异常死亡和裸鼠体重异常降低的现象。结论：1.RPM可与siRNA分子通过自组装形成球形纳米复合物,制备过程简单,而且纳米复合物的血清稳定性好。2.RPM/siRNA纳米复合物可特异性地进入表达整合素αvβ3受体的细胞中,提示该纳米复合物可经受体介导而进入细胞；并能有效地沉默靶基因。3.RPM/siRNA纳米复合物没有明显的细胞毒性。4.RPM/siRNA纳米复合物可以通过整合素αvβ3受体的介导,有效地抑制斑马鱼胚胎新生血管生成。5.RPM/siRNA纳米复合物经裸鼠尾静脉注射给药后,可靶向于裸鼠的肿瘤部位,通过对靶基因的沉默而抑制新生血管的生成。6.RPM/siRNA纳米复合物可有效地抑制裸鼠肿瘤生长,其机制为抑制肿瘤相关基因的表达(VEGFR2),抑制抗肿瘤部位新生血管的生成等。7.体内试验表明RPM/siRNA纳米复合物无免疫刺激、无明显的肝肾毒性,具有一定的安全性。