苹果酸-乳酸发酵(Malolactic fermentation,MLF)主要由酒酒球菌(Oenococcus oeni,O.oeni)主导进行,能够有效地降低葡萄酒酸度、增加生物稳定性、修饰风味。在葡萄酒生产过程中,为避免自然MLF引起挥发酸、生物胺等含量过高,通常添加O.oeni发酵剂。发酵剂的制备通常采用冷冻干燥法,但在冻干过程中O.oeni易受损伤而导致细菌死亡或活力降低。在冻干过程中添加冷冻干燥保护剂则能有效降低细菌损伤。本实验室研究发现O.oeni 28A-1在生长代谢过程中分泌的可溶性胞外聚合物,在冻干过程中起到显著的抗冻干的效果。有研究发现细菌胞外聚合物中的胞外多糖(Exopolysaccharide)在冷冻保护作用中起主导作用。我们推测可溶性胞外聚合物的冻干保护性能可能归因于它们所含有的胞外多糖。因此,本研究探究了O.oeni胞外聚合物中的胞外多糖是否在抵抗冷冻干燥中起主导作用,并对胞外多糖的理化性质、结构以及生物活性进行了初步研究。深入了解O.oeni胞外多糖可为构效关系的研究提供信息,为其作为酿酒乳酸菌天然冻干保护剂提供参考,也为日后人工合成这种胞外多糖提供理论基础。本文首先提取O.oeni 28A-1的胞外多糖进行冻干保护性能验证,为后续实验奠定基础。然后,测定胞外多糖的理化性质以及初步表征其结构。最后,进行抗氧化活性研究。主要研究结果如下:(1)O.oeni在生长稳定期后多糖分泌增多,ATB培养基条件下,O.oeni 28A-1产糖的最佳发酵时间为12天。不同培养基条件下生长的O.oeni的胞外多糖的产量、冻干保护性能存在显著差异。ATB培养基条件下生长的O.oeni 28A-1产生的胞外多糖在产量与冻干保护性能方面均显著高于生长在SMD培养基下产生的胞外多糖。(2)ATB培养基下生长的O.oeni 28A-1胞外多糖的冻干保护性能显著高于培养基本身含有的多糖的冻干保护性能,因此EPS(下文中的EPS均表示ATB培养基条件下生长的O.oeni 28A-1胞外多糖)优良的冻干保护性能主要源于O.oeni分泌的胞外多糖,排除了培养基多糖的干扰。添加冷冻干燥保护剂能显著提高O.oeni冷冻干燥存活率,其中保护效果最好的是2.5%EPS,其冷冻干燥细菌存活率可达81.43%±9.87%,显著高于其他常用冻干保护剂(海藻糖、蔗糖、谷氨酸钠),也高于O.oeni胞外聚合物的细菌存活率,因此O.oeni胞外聚合物的胞外多糖在抗冻干中起主导作用,O.oeni EPS具有作为天然冻干保护剂的巨大潜力。(3)在EPS理化性质探究中,EPS的糖含量高于培养基本身含有的多糖的糖含量,间接说明O.oeni 28A-1产生了胞外多糖,而且起到了冻干保护的关键作用。EPS中蛋白质含量为0.49%,残留蛋白质主要是与多糖共价结合的蛋白多糖。紫外全波长扫描发现EPS在260 nm、280 nm附近存在弱吸收峰,表明EPS中含有痕量的核酸、蛋白,EPS中少量的蛋白、核酸的存在对其生物活性起着至关重要的作用。凝胶渗透色谱测得EPS的Mw为7.73×10~4Da,较高Mw的胞外多糖可以更好地降低极端低温对菌株的损伤。差示扫描量热法测得EPS的吸收热为116.67℃,相对较高的吸热值表明它具有较强的持水力,可减缓冻干过程中干燥失水对细胞造成的损伤,起到冻干保护的作用。EPS的降解温度为259.47℃,与多糖热性能报告一致,表明EPS的主要成分是多糖,较高的降解温度表明EPS具有良好的热稳定性。(4)在EPS结构表征中,采用高效液相色谱法分析EPS单糖组成,EPS为杂多糖,由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和半乳糖醛酸组成。采用傅里叶变换红外光谱测定分析EPS的主要官能团,EPS的FT-IR光谱图显示了多糖的各种特征吸收峰。采用SEM和AFM观察固体和液体形式下EPS的微观形态结构,SEM图像显示EPS固体为不规则的结构,表面粗糙,并且具有一定的层状结构,AFM图像显示EPS在溶液中呈不规则的颗粒结构,粒子分布相对均匀,某些区域发生聚集,EPS微观结构类似于果胶半纤维素多糖,易于嵌入和附着目标样品,因此在相关研究领域中可用作保护剂或载体。(5)EPS抗氧化活性分析表明,EPS在清除ABTS,DPPH,羟基和超氧阴离子自由基方面具有一定的活性。还原能力分析表明EPS通过多种机制达到抗氧化目的。因此,EPS具有良好的抗氧化活性,相比其他冻干保护剂,EPS不仅能够提升菌的存活率,还能够提升葡萄酒的抗氧化活性,拓宽了应用范围,使其更具有应用价值。