【摘 要】
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胰岛素样生长因子1（insulin like growth factor 1,IGF1）与肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）作为动物机体肌肉生长的调控因子,对成肌细胞的增殖具有重要作用。本研究以关岭牛为研究材料,通过分子克隆、CCK8、qPCR技术、细胞划痕、流式细胞术等技术研究IGF1、MSTN基因对关岭牛成肌细胞增殖的影响,进一步了解关岭牛肌肉生长发育规律,为关岭牛肉质改良提供细胞
【基金项目】
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教育部促美大项目“FoxO6转录因子与MSTN启动子相互作用的分子机制研究”【2015】2062号（31571279）；
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胰岛素样生长因子1（insulin like growth factor 1,IGF1）与肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）作为动物机体肌肉生长的调控因子,对成肌细胞的增殖具有重要作用。本研究以关岭牛为研究材料,通过分子克隆、CCK8、qPCR技术、细胞划痕、流式细胞术等技术研究IGF1、MSTN基因对关岭牛成肌细胞增殖的影响,进一步了解关岭牛肌肉生长发育规律,为关岭牛肉质改良提供细胞水平基础数据参考。1.关岭牛IGF对成肌细胞增殖的作用研究对关岭牛IGF1基因序列进行氨基酸组成分析、蛋白结构分析等生物信息学分析,探究IGF1基因在关岭牛各组织中的m RNA表达差异;培养关岭牛骨骼肌成肌细胞并进行纯度鉴定;构建pEGFP-C1-IGF1过表达载体与p GPU6-GFP-Neo干扰载体;运用CCK8、qPCR技术、细胞划痕和流式细胞术检测IGF1基因对关岭牛成肌细胞增殖的影响。结果表明,IGF1基因在肝中表达量最高,极显著高于其他组织（P＜0.01）;IGF1蛋白的分子式为C744H1186N214O216S15,相对分子质量为17.06581 k D,理论等电点为9.36,属碱性不稳定蛋白;IGF1基因过表达后,细胞增殖相关基因cyclin A2、cyclin B1和PCNA的表达量均极显著高于对照组（P＜0.01）,而沉默IGF1基因,细胞增殖相关基因cyclin A2、cyclin B1和PCNA的表达量均极显著降低（P＜0.01）;CCK8结果显示,IGF1基因过表达后,细胞增殖能力增强;IGF1基因被沉默后,细胞中增殖能力减弱;转染过表达组成肌细胞迁移活动明显增强,细胞迁移率极显著升高（P＜0.01）,与此相反,干扰组成肌细胞迁移活动明显减弱,细胞迁移率极显著降低（P＜0.01）;过表达IGF1基因增加了增殖细胞比例,促使大量成肌细胞由G1期进入S期,而干扰IGF1基因表达与之相反。即IGF1基因对成肌细胞增殖具有正向调控作用。2.关岭牛MSTN对成肌细胞增殖的作用研究将构建成功的MSTN基因干扰载体转染至成肌细胞筛选鉴定;运用CCK8、qPCR技术、细胞划痕和流式细胞术探究MSTN基因对关岭牛成肌细胞增殖的影响。结果表明在成肌细胞过表达MSTN基因会极显著下调细胞增殖相关基因cyclin A2、cyclin D1表达（P＜0.01）,而沉默MSTN基因会极显著上调cyclin A2、cyclin D1基因表达（P＜0.01）;CCK8结果表明,过表达MSTN基因抑制成肌细胞增殖,而干扰MSTN基因促进成肌细胞增殖;过表达MSTN基因会极显著下调成肌细胞迁移率（P＜0.01）,而沉默MSTN基因会极显著上调成肌细胞迁移率（P＜0.01）;在成肌细胞中过表达MSTN基因会极显著减少细胞周期S期细胞数量（P＜0.01）,而沉默MSTN基因会增加S期细胞数量。即MSTN基因对成肌细胞的增殖具有抑制作用。3.关岭牛IGF1、MSTN对成肌细胞增殖的作用研究通过脂质体分别共转染IGF1、MSTN基因过表达载体与干扰载体,运用CCK8、qPCR技术、细胞划痕和流式细胞术检测IGF1与MSTN基因共同作用对成肌细胞增殖的影响。结果表明IGF1、MSTN基因共表达极显著下调细胞增殖相关基因Cyclin A2、Cyclin B1表达（P＜0.01）,而共干扰上调Cyclin A2、Cyclin B1基因表达;CCK8结果显示,共表达抑制成肌细胞增殖,而共沉默促进成肌细胞增殖;共表达极显著下调成肌细胞迁移活动（P＜0.01）,而共干扰极显著上调成肌细胞迁移率（P＜0.01）;共表达极显著减少细胞周S期细胞数量,而共沉默极显著增加S期细胞数量（P＜0.01）,即在关岭牛成肌细胞中MSTN基因调控IGF1基因介导的成肌细胞增殖。综上所述,IGF1基因对成肌细胞增殖具有正向调控作用,与之相反MSTN基因对成肌细胞增殖具有负向调控作用,而IGF1、MSTN相互作用共同调控成肌细胞增殖过程中,MSTN基因调控IGF1基因介导的成肌细胞增殖。
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