肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,Spn)是呼吸道感染的主要病原菌之一,已可以引起脑膜炎、胸膜炎、败血症等。以青霉素为代表的β内酰胺类药物和以红霉素为代表的大环内酯类药物,曾是抗肺炎链球菌感染的一线药物,而两类药物的耐药率不断攀升,给临床治疗带来了极大困难。本研究通过比较肺炎链球菌耐药特征,分析高毒力菌株全基因组和整合性接合元件,研究其耐药机制。目的:调查2015年10月至2016年6月某医院临床所分离62株肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae,Spn)的耐药特征,为临床正确使用抗生素提供依据;了解肺炎链球菌SWU02全基因组基本特征,分析其耐药基因;分析肺炎链球菌SWU02全基因组的整合性接合元件(Integrative and Conjugative Element,ICE)的遗传特征,研究其耐药播散机制。方法:(1)收集2015年10月至2016年6月某医院临床分离的62株肺炎链球菌,用法国梅里埃VITEK-2 Compact全自动微生物鉴定仪鉴定菌种,用E-test方法检测其对14种临床常用抗菌药物的耐药情况。(2)通过第三代高通量测序技术对肺炎链球菌SWU02进行全基因测序,原始测序结果进行拼接、组装、基因预测、基因功能注释、耐药基因和毒力基因分析。用多点位序列分型技术(MLST)分析肺炎链球菌SWU02的ST型别,在NCBI Gen Bank数据库查找并下载肺炎链球菌常见血清型序列19A、19F、23F、6A/B、14B/C、15B/C,通过BLAST比对确定肺炎链球菌SWU02血清型。(3)用隐马尔科夫模型识别肺炎链球菌SWU02的整合性接合元件,NCBI数据库和ICEmerg数据库检索肺炎链球菌整合性接合元件(ICE)的参考序列,将肺炎链球菌SWU02整合性接合元件序列与其进行比较。结果:(1)62株肺炎链球菌对青霉素(PEN)和红霉素(ERY)耐药率为100%,对四环素(TE)、阿奇霉素(AZM)、阿莫西林(AMC)、复方新诺明(SXT)耐药率较高,分别为95.2%、75.8%、72.6%、71.0%。对左氧氟沙星(LEV)、莫西沙星(MXF)、利奈唑胺(LNZ)、万古霉素(VAN)耐药率较低,分别为12.9%、11.3%、6.4%、0.0%、0.0%。(2)测序结果表明,SWU02基因组含有2092148 bp个碱基,G+C碱基占39.77%。共挖掘出2120个各种编码基因,2012个CDS(蛋白质编码区),93个假基因,13个r RNAs(包括5S,16S,23S),58个t RNAs,6个nc RNA。主要耐药基因包括对喹诺酮类抗生素耐药基因gyr A、gyr B,对大环内酯类抗生素耐药基因erm B、mef A、mre C、mre D,对四环素类抗生素耐药基因tet A、tet C、tet M。另外含有12个经典的肺炎链球菌毒力基因psp C、lyt A、lyt B、rrg A、nana、iga、ply、hys A stk P、clp P、cps2A、pcs B。序列提交到NCBI数据库得到登录号为CP018347,遗传进化分析,该菌株与登录号为CP006844菌株遗传距离最近。SWU02经多点位序列分型和血清分型,确定型别为ST271,19F,该型别以多重耐药和同时携带erm B和mef基因为主要特点。(3)通过比较发现该菌株在ORF91到ORF115区域存在整合性接合元件(ICE)结构,该ICE属于Tn916家族,序列全长25881bp,GC含量38.7%,含有25个ORF,所编码蛋白依次为:DUF961、DUF961、Fts K、rst A1、erm B、Transposase、conjugal transfer protein、Ard A、membrane protein、ATP/GTP、conjugative transposon、Nlp C/P60、conjugative transposon、tet M、umu C、Ims C、Yol D、mel、hypothetical protein、Mef(A)、DNA recombinase hypothetical protein、helix-turn-helix protein、DNA-binding protein、Xis、int。结论:(1)所分离的肺炎链球菌对β-内酰胺类抗菌药物耐药率为32.6-72.3%,大环内酯类抗菌药物耐药率为75.8-100%,四环素类抗生素耐药率为95.2%,耐药情况严峻。(2)全基因测序表明,肺炎链球菌SWU02基因组全长2092148 bp,G+C碱基占39.77%,含有Erm B、Tet(M)、Mef(E)等耐药基因和12个毒力基因,可能导致该菌株对多类抗菌药物多重耐药并表现出高毒力。(3)SWU02(ST271,19F)ICE属于TN916家族,同时携带有mef(A)erm B,tet M,青霉素耐药相关蛋白ATP/GTP耐药基因,此外还含有转座子可能与耐药基因的播散有关。