锰是人体必需的一种微量元素,是多种酶类的重要组成部分,在机体生理功能的维持和生长发育的进行中扮演着重要作用。但是过量的锰暴露会导致帕金森病(PD)样的机能异常改变,这些改变统称为锰中毒。锰中毒患者出现的帕金森病样改变包括运动迟缓、震颤、强直和姿势异常等。在啮齿类和灵长类动物模型中,锰的过量暴露会导致脑区内锰的聚集、γ-氨基丁酸(GABA)能和多巴胺(DA)能神经传递受损、胶质细胞活化,最终导致神经元数量减少。锰在生活中的应用十分广泛,如钢铁焊接、真菌毒剂、农业化肥、干电池等都需要锰的存在,这使人群接触锰的可能性大大增加,过量锰暴露对机体造成的危害成为人们关心的环境健康问题。关于锰毒性机制的研究,多数研究者关注锰对神经元的直接毒性作用,认为锰暴露致神经元氧化应激和线粒体功能异常可以导致神经元凋亡。我们实验室前期研究发现,锰诱导神经胶质细胞产生的炎症反应也会对神经元产生影响。锰暴露后小鼠纹状体和苍白球区的一氧化氮(NO)含量增高,纹状体区炎性因子(如IL-1β)增加,这些研究从另一个侧面说明了锰的神经元毒性可能与胶质细胞产生的各类细胞因子有关。小胶质细胞是大脑内的常驻免疫细胞,占大脑总体积的10%-15%,主要分布于致密的灰质区,如海马和基底节。在正常生理状态下,小胶质细胞处于静息态,但可以不断伸缩以感受周围环境的改变。在遇到外部刺激或病理改变时,小胶质细胞可以迅速活化并释放炎性因子,其释放的炎性因子主要包括肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β、IL-6等;此外,还可同星形胶质细胞一同释放活性氧簇(ROS)、一氧化氮(NO)和前列腺素(PG)E2。本教研室前期研究已证明锰可以诱导小胶质细胞的活化,进而引起神经炎症反应。肿瘤坏死因子受体作用因子(TRAF)3是TRAFs家族的成员,主要参与TNF-α受体家族信号通路,其结构特点是在C末端具有蜷曲螺旋结构,并均具有保守的TRAF结构域。TRAF3基因敲除小鼠出生后无法长时间存活,证实TRAF3在维持正常生长发育和生理功能方面的重要作用。之后的研究进一步证实,TRAF3具有负向调节NF-κB信号通路的作用。另有研究发现,TRAF3还具有负向调节MAPK信号通路及正向调节Ⅰ型干扰素产生的作用。近年来,有新研究发现,TRAF3还可能负向调节钙调蛋白磷酸酶活性。综上所述,TRAF3在免疫信号通路中具有重要作用。目的:通过建立小胶质细胞的锰暴露模型,探讨锰暴露对小胶质细胞形态及炎症反应的影响。利用基因芯片技术研究锰暴露对中枢神经系统基因表达谱的影响,进一步研究锰诱导小胶质细胞炎症反应的机制,为锰神经毒性机制的研究提供实验依据。方法:1.建立锰暴露小胶质细胞模型;2.采用噻唑蓝(MTT)法绘制细胞生长曲线并确定最佳接种密度;3.采用免疫荧光化学染色方法鉴定小胶质细胞并确定锰暴露对其形态的影响;4.采用实时荧光定量q RT-PCR法检测锰暴露对小胶质细胞趋化因子mcp1、cxcl1,炎性因子tnf-α,免疫信号通路分子traf3、lrrk2、akr1b3 m RNA表达的影响;5.采用酶联免疫吸附剂(ELISA)法测定小胶质细胞内趋化因子MCP1、CXCL1蛋白水平,以及细胞释放的炎性因子TNF-α水平;6.采用基因芯片方法,筛选锰暴露对中枢神经系统基因表达谱的影响;7.采用免疫蛋白印迹(Western Blot)法检测锰暴露对小胶质细胞TNF-α、TRAF3蛋白表达的改变;8.采用细胞转染方法,检测高表达TRAF3对锰诱导小胶质细胞炎症反应的影响。结果:1.绘制BV2细胞生长曲线并确定最佳接种密度取处于对数生长期的BV2细胞制成细胞悬液后以不同的细胞密度接种于96孔板,并在培养不同时间后取出,按步骤加入MTT溶液及二甲基亚砜(DMSO),震荡后利用酶联免疫检测仪测定其吸光度值(A),根据测定结果绘制细胞生长曲线,并进一步确定细胞最佳接种密度。2.锰暴露致BV2小胶质细胞形态发生改变利用免疫荧光化学染色方法,对照组和锰暴露后的BV2细胞进行染色,观察BV2细胞形态的改变,并对形态发生改变的BV2细胞进行计数,结果表明,锰暴露后发生形态改变的BV2细胞比例明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),且100μM锰暴露组高于50μM锰暴露组,差异有统计学意义(P<0.05)。3.锰暴露后BV2细胞趋化因子mcp1、cxcl1 m RNA表达发生改变利用q RT-PCR方法检测证实,与对照组相比,锰暴露可致BV2细胞趋化因子mcp1、cxcl1的m RNA表达增加,差异有统计学意义(P<0.05),且100μM锰暴露组高于50μM锰暴露组,差异有统计学意义(P<0.05)。4.锰暴露后BV2细胞炎性因子TNF-α的表达和释放增加利用q RT-PCR方法检测证实,与对照组相比,锰暴露可致BV2细胞炎性因子tnf-α的m RNA表达增加,差异有统计学意义(P<0.05),且100μM锰暴露组高于50μM锰暴露组,差异有统计学意义(P<0.05);Western Blot和ELISA结果显示,锰暴露可致BV2细胞TNF-α的蛋白含量增加,差异有统计学意义(P<0.05),且100μM锰暴露组高于50μM锰暴露组,差异有统计学意义(P<0.05)。5.基因芯片结果显示锰暴露影响黑质区基因表达谱通过脑立体定位注射方法建立大鼠锰中毒的动物模型,采用Affymetrix Rat Gene2.0 ST表达谱芯片筛选差异表达的基因,发现锰处理后大鼠黑质中有1107个基因相对于对照组表达上调,有633个基因相对于对照组表达下调。对这些差异表达的基因进行功能分类,发现锰的毒性作用涉及多种信号分子,包括:神经递质、神经发育、信号转导、神经免疫、物质运输、代谢等,这表明锰神经毒性是由多种机制参与的。在差异表达的基因中,包括TNF-α上游调控分子TRAF3,差异倍数(FC值)为-4.56,这提示TRAF3可能参与了锰诱导BV2细胞TNF-α表达增高及释放。6.锰暴露后BV2细胞TRAF3表达降低利用q RT-PCR方法检测证实,锰暴露可致BV2细胞traf3的m RNA表达降低,差异有统计学意义(P<0.05),且100μM锰暴露组低于50μM锰暴露组,差异有统计学意义(P<0.05);Western Blot表明,锰暴露可致BV2细胞TRAF3的蛋白含量降低,差异有统计学意义(P<0.05),且100μM锰暴露组低于50μM锰暴露组,差异有统计学意义(P<0.05)。7.高表达TRAF3可抑制锰诱导BV2细胞趋化因子表达增加构建TRAF3高表达质粒,在BV2细胞中转染质粒使TRAF3高表达,Western blot和q RT-PCR均证实转染后,BV2细胞内TRAF3表达增高。8.高表达TRAF3可抑制锰诱导BV2细胞表达和释放炎性因子TNF-α在BV2细胞中转染TRAF3使其高表达,Western blot和q RT-PCR均证实转染后,BV2细胞能高表达TRAF3。质粒转染后进行锰刺激,利用ELISA法检测炎性因子TNF-α的改变,结果显示,TRAF3高表达后,锰刺激TNF-α的改变较对照组降低,且此降低具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.锰暴露可以导致小鼠小胶质细胞BV2的形态发生改变,由静息态转为活化态。2.锰暴露后BV2细胞趋化因子MCP-1和CXCL1的表达增加,炎性因子TNF-α的表达和释放增加,说明锰的神经毒性可能与诱导小胶质细胞的炎症反应有关。3.锰暴露后BV2细胞信号通路分子TRAF3的表达下降,且高表达TRAF3对锰诱导BV2细胞分泌炎性因子有影响,说明锰可能通过TRAF3通路对炎性因子的释放起到调节作用。