多杀菌素(spinosad)是由刺糖多孢菌Saccharopolyspora spinosa在有氧条件下发酵而成的一种新型聚酮类化合物,兼具化学农药的高效性和生物农药的绿色安全性,对鳞翅目Lepidoptera、双翅目Diptera、鞘翅目Coleoptera等农作物害虫有很好的防治作用,其主要活性组分为spinosad A和spinosad D。然而,刺糖多孢菌野生型菌株多杀菌素产量相对较低且发酵时间长,限制了多杀菌素的推广应用。至今,对刺糖多孢菌中与初级代谢及次级代谢相关的调控基因研究得较少,可以运用基因工程技术对刺糖多孢菌进行定向遗传改造,增加或阻断与多杀菌素合成相关的调控基因的表达以期提高多杀菌素的生物合成量。核糖体循环因子(Ribosome recycling factor,RRF)是由Frr基因编码,在蛋白质的合成过程中对核糖体再循环起关键作用的物质,能对翻译终止后复合体进行解体,为新一轮蛋白质的合成供应充足的核糖体。本文通过在刺糖多孢菌中过表达核糖体循环因子,以研究其对刺糖多孢菌的形态分化及多杀菌素合成的影响。通过构建过表达载体pUC-spn-PermE-Frr,将其导入至刺糖多孢菌野生菌中获得重组菌株S.spinosa-Frr,以导入了原始质粒pUC-spn的刺糖多孢菌的S.spinosa-1和刺糖多孢菌野生型菌株S.spinosa及作为对照。HPLC结果显示,重组菌株S.spinosa-Frr相对于野生菌株S.spinosa提高了300%,相对于S.spinosa-1多杀菌素产量提高了 132%;经过扫描电子显微镜观察发现,重组菌株与野生菌株的菌丝形态大体一致,菌丝长且分支多,而菌株S.spinosa-1的菌丝短且分支少;说明Frr基因的过量表达对多杀菌素的合成有明显的促进作用,且对刺糖多孢菌的形态分化产生了一定的影响,这对刺糖多孢菌高产菌株的选育具有重要意义。磷酸甘露酶由manB基因编码的广泛存在于真核生物中的蛋白酶,在糖代谢过程中磷酸-6-甘露糖可在磷酸甘露酶(PMM)的作用下能转化为磷酸-1-甘露糖,与细胞的初级代谢过程及次级代谢产物的合成过程密切相关,可通过对刺糖多孢菌中与初级代谢途径相关的基因进行基因改造,促使多杀菌素的合成显著提高。从刺糖多孢菌基因组中克隆了manB基因部分片段,将其与穿梭载体pOJ260连接,构建了阻断型载体pOJ260-manB。通过接合转移将其导入刺糖多孢菌野生菌中,获得刺糖多孢菌突变菌株S.spinosa-ΔmanB 在HPLC上检测多杀菌素的产量发现突变菌株的产量相对于野生菌株提高了180%;将突变菌株接种至不同培养基,观察突变菌株与野生菌株的孢子形成情况,发现突变菌株的孢子萌发有所提前,且孢子产生量比野生菌略多;这说明manB基因对调控多杀菌素的合成具有重要作用,并对刺糖多孢菌的生长发育有一定的影响。本文首次在刺糖多孢菌中对Frr基因和manB基因进行了功能研究,通过定向遗传改造的方法成功构建了多杀菌素高产菌株,奠定了遗传修饰刺糖多孢菌基因组以提高多杀菌素生物合成的重要基础。