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研究背景与目的恶性黑素瘤(malignant melanoma,MM)是一种高度恶性的肿瘤,发生隐蔽,易发生血管和淋巴结转移,发展迅速、预后差、死亡率高。删的生长和转移依赖于肿瘤内的血管生成(angiogenesis),而血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor,VEGF)在肿瘤血管生成机制中处于核心地位。研究表明MM血管生成十分活跃,VEGF作为最重要的促血管生成因子而逐渐成为研究热点。已知的大麻素受体(cannabinoid receptor CB-R)分为Ⅰ型大麻素受体(cannabinoid receptor 1,CB-R1)和Ⅱ型大麻素受体(cannabinoid receptor 2,CB-R2),均为G-蛋白偶联受体(G-protein coupled receptors,GPCRs),GPCRs在肿瘤的生长和血管生成中具有重要作用。研究表明CB-R2具有抗炎症、抗增殖、抗肿瘤等作用,CB-R2激动剂体外试验可诱导细胞凋亡,体内试验可抑制肿瘤的生长而无明显的副反应。本课题组前期研究发现,CB-R2受体在MM组织中呈高表达,但对其在删中是否参予迁移、侵袭和血管生成的作用机制尚不完全明确。如能证实CB-R2激动剂具有抗血管生成和抑制肿瘤生长的功能,其可能成为治疗MM新的抗血管生成靶点药物。本课题的目的是通过体外和体内实验模型,拟证明CB-R2参与MM的发病过程,探讨CB-R2受体激动剂JWH-133和WIN55,212-2在MM中的抗肿瘤活性和抗血管生成的作用与机制,为其在临床应用提供新思路。研究方法1.体外实验以人恶性黑素瘤A375细胞为研究模型应用免疫荧光检测CB-R2在A375细胞中的表达与定位;RT-PCR和Westernblot检测CB-R2在A375细胞中mRNA和蛋白水平的表达;Real time PCR和免疫组化检测CB-R2激动剂JWH-133和WIN55,212-2对A375细胞CB-R2表达的影响;MTT、划痕实验和Transwell小室模型检测JWH-133和WIN55,212-2对A375细胞增殖、迁移和侵袭作用的影响;Real-time PCR、和ELISA检测JWH-133和WIN55,212-2对A375细胞VEGF在mRNA和蛋白水平表达的影响;TUNEL检测JWH-133和WIN55,212-2对A375细胞凋亡的影响。2.体内实验以人恶性黑素瘤A375细胞裸鼠移植瘤为研究模型建立人恶性黑素瘤裸鼠移植瘤动物模型,观察体内成瘤情况。应用免疫荧光检测瘤组织中CB-R2的表达与定位;Real-time PCR、western blot和免疫组化检测CB-R2激动剂JWH-133和win55,212-2对肿瘤组织中CB-R2和VEGF在mRNA和蛋白水平表达的影响;TUNEL检测JWH-133和win55,212-2对肿瘤组织细胞凋亡的影响。结果1.人恶性黑素瘤A375细胞体外模型实验结果①人恶性黑素瘤A375细胞在mRNA和蛋白水平均表达CB-R2,其表达定位于胞浆和胞膜,胞核无染色。②不同浓度JWH-133和WIN55,212-2(0.01/0.1/1/10/100umol/L)对A375细胞增殖具有抑制作用,48h达到高峰(P＜0.05);而两种药物对A375细胞增殖的抑制作用,经统计学分析比较无明显差异(P＞0.05)。③JWH-133和WIN55,212-2抑制A375细胞的迁移和侵袭能力;与对照组比较,1umol/L浓度JWH-133组和WIN55,212-2组细胞相对迁移面积显著降低,差异具有统计学意义(P＜0.05);1umol/L浓度JWH-133组和WIN55,212-2组细胞穿膜细胞数与对照组比较明显减少,差异具有统计学意义(P＜0.05);而两种药物组的细胞相对迁移面积和穿膜细胞数,经统计学分析比较无明显差异(P＞0.05)。④不同浓度JWH-133和win55,212-2(1umol/5umol/10umol/L)刺激A375细胞24h,48h和72h后,可降低VEGF在不同时相点mRNA和蛋白水平的表达,与对照组比较差异具有统计学意义(P＜0.05);并且这种抑制效应呈时间剂量依赖关系,JWH-133和WIN55,212-2剂量越大,刺激时间越长,VEGF表达的降低越明显。⑤1umol/L浓度JWH-133和WIN55,212-2刺激A375细胞24h,48h和72h后,可诱导A375细胞凋亡,JWH-133组A375细胞凋亡率分别为7.22%、9.1 7%和11.45%;WIN5 5,212-2组A375细胞凋亡率分别为6.45%、8.12%和10.34%;而对照组凋亡率为6.35%、6.09%和6.39%,JWH-133组和WIN55,212-2组与对照组凋亡率比较,差异具有统计学意义(P＜0.05);而两种药物之间经统计学分析比较无明显差异(P＞0.05)。2.人恶性黑素瘤A375细胞裸鼠移植瘤模型实验结果①JWH-133和WIN55,212-2可以抑制人恶性黑素瘤裸鼠移植瘤的生长,抑瘤率分别为43.14%和39.47%。②予JWH-133和WIN55,212-2,肿瘤组织可在mRNA和蛋白水平上调CB-R2的表达,与对照组比较,差异具有统计学意义(P＜0.05);而两种药物之间经统计学分析比较无明显差异(P＞0.05)。③JWH-133和WIN55,212-2在mRNA和蛋白水平降低肿瘤组织中VEGF的表达;与对照组比较,差异具有统计学意义(P＜0.05);两种药物之间经统计学分析比较无明显差异(P＞0.05)。④JWH-133和WIN55,212-2可诱导肿瘤组织中肿瘤细胞凋亡,对照组、JWH-133组和WIN55,212-2组肿瘤组织凋亡率分别为7.33%、12.84%和11.57%。JWH-133组和WIN55,212-2组与对照组凋亡率比较,差异具有统计学意义(P＜0.05);而两种药物之间经统计学分析比较无明显差异(P＞0.05)。结论1.大麻素Ⅱ型受体CB-R2参与了MM的发病过程;2.JWH-133和WIN55,212-2可以抑制A375细胞增殖、迁移和侵袭的能力;3.体外和体内实验模型中,JWH-133和WIN55,212-2可诱导MM肿瘤细胞凋亡:4.体外和体内实验模型中,JWH-133和WIN55,212-2可降低MM肿瘤细胞和组织VEGF的表达和分泌,抑制血管生成,控制肿瘤的生长;5.JWH-133和WIN55,212-2在抑制恶性黑素瘤细胞增殖、迁移、侵袭能力以及促进细胞凋亡等作用机制方面,二者无显著差异。