肝脏具有重要的生理功能,近年来的研究显示多种细胞因子参与病毒性肝炎、酒精性肝损伤、脂肪肝、肝细胞肝癌等慢性肝病的发病过程。其重要发生过程是:在损伤因子作用下,激活肝脏Kupffer细胞(KC)释放大量细胞因子,通过调控肝星状细胞(HSC)中相应信号通路,促进HSC细胞的活化增殖,合成以胶原为主的ECM过度沉积于肝脏,引起肝脏发生病理改变,发展成肝硬化,甚至肝癌。研究发现HSC在肝脏的炎症反应过程中可能会发挥重要的作用。在多种因素如病毒感染药物作用等导致肝损伤后,HSC等肝脏细胞分泌多种细胞因子,如IL-1,IL-6及IL-10等。HSC膜上特异性受体可以识别这些细胞因子,进一步将信号通过细胞内的信号转导通路传递到核内,激活核内存在的某些关键性的转录因子,最终达到促进相关靶基因的转录和表达的目的。在此过程中,激活后的HSC可产生大量的促炎因子和促纤维化因子并通过旁分泌和自分泌作用,进一步刺激未激活转化的HSC转变为肌成纤维细胞,使肝纤维化形成正反馈。炎症反应作为肝纤维化形成和启动因素,是促其形成肝纤维的原因,减轻炎症有助于阻止肝纤维化的发生。而HSC作为肝纤维化主要的效应细胞,其在炎症反应中的作用还不明确。根据前面相关研究基础,选择从HSC的炎症反应过程的分子机制进行深入探讨,将对寻找遏制肝脏炎症,并进一步阻断或逆转肝纤维化的新的靶点和策略有非常积极的作用。近年来研究表明HSC的活化是肝纤维化形成的关键事件,而核转录因子kappa B(Nuclear factor kappa B,NF-κB)是目前研究发现调节这一过程的关键因子。NF-κB的激活可见于HSCs由静止到激活的过程中。越来越多的研究表明有些药物,它可以抑制NF-κB活化,同时具有抗肝纤维化的作用。研究发现它可以诱导HSC凋亡,逆转实验性抗肝纤维化。在肝纤维化时期,激活的HSCs内可以发现NF-κB的活性增强,TNF-α、IL-6等炎性因子表达随之增加,肝脏炎症损伤反应随之进一步增强;同时激活态HSCs中NF-κB活性持续存在着,它可以降低HSC凋亡,促进其活化、增殖及移动。因此,选择通过抑制NF-κB的活性,促进HSC的凋亡,将也许会逐渐成为逆转肝纤维化的新方法,并将发挥很重要的作用。同时NF-κB具有促进致炎性转录因子表达的作用,已经成为联系炎症-纤维化-肿瘤进程的关键性调控因子。在炎症和纤维化形成过程中NF-κB发挥重要作用,寻找其内源性调控因子可能成为防治肝脏炎症和纤维化的重要靶点。最新文献报道,天然免疫系统中的NOD样受体(NOD-like receptor,NLR)家族成员之一,NLRC5的蛋白分子直接与先天免疫细胞NF-κB信号通路中IKKα和IKKβ结合,从而抑制其磷酸化,能够有效调控免疫细胞的活性,以避免炎症反应不断增强造成对机体本身的损伤。且课题组前期研究发现,NLRC5可以负调控RAW264.7细胞中IL-6,TNF-α等促炎因子的分泌。但是NLRC5在肝脏炎症及肝纤维化中的调控作用,尤其是对HSC的活化及相关炎症因子的相关作用还未见报道。于是本实验重点研究NLRC5在肝脏炎症及肝纤维化中的作用,尤其是对HSC活化增殖中的作用,为肝纤维化防治提供新的思路,阐明肝纤维化形成中相关的分子机制,对抗肝纤维化药物的研发,减少肝硬化及原发性肝细胞癌的发生具有十分重要的意义。主要研究内容概括如下:1.NLRC5在纤维化肝脏组织的表达情况实验选取人体肝血管瘤组织作为正常肝组织,选取肝炎后肝硬化患者及肝癌患者癌旁2 cm以外作为肝纤维化组织。另选取CCl4诱导的肝纤维化小鼠模型,采用免疫组化、RT-PCR、Western blot等方法检测NLRC5的基因与蛋白的表达变化。并使用免疫双染的方法观察NLRC5的定位情况。结果发现:与正常肝组织相比,人体肝纤维化组织及小鼠肝纤维化组织中NLRC5基因与蛋白的表达明显增高,且主要表达于肝星状细胞。2.NLRC5对LX-2细胞活化及分泌炎症因子的调控作用体外实验部分以人源肝星状细胞株LX-2为研究对象选取TGF-?1处理细胞,结果表明,与正常组比较,TGF-?1刺激后可以明显升高LX-2细胞中NLRC5m RNA与蛋白表达水平。提示NLRC5可能参与调控HSC的活化增殖,影响肝纤维化的进程。通过脂质体LipofectamineTM 2000分别转染NLRC5-si RNA和Scrambled-si RNA进入到LX-2细胞内,Real-time q PCR、Western blot检测显示,特异性阻断NLRC5后,HSC活化标志物α-SMA的m RNA与蛋白明显降低。进一步研究发现,转染NLRC5-si RNA后,可明显抑制Colla-1水平。通过脂质体LipofectamineTM 2000分别转染p EGFP-C2-NLRC5和p EGFP-C2,在过表达NLRC5组,明显表现与沉默组相反的结果,提示NLRC5有促纤维化形成的作用。进一步我们观察NLRC5是否会对HSC分泌炎症因子发挥作用。结果发现,用TNF-α刺激LX-2细胞后,NLRC5的表达水平明显升高。在TNF-α刺激LX-2细胞后,IL-1β,IL-6的表达水平明显升高。沉默NLRC5后可明显抑制IL-1β,IL-6的表达。相反我们通过脂质体转染法分别向LX-2细胞中转染p EGFP-C2-NLRC5和p EGFP-C2。结果发现,在p EGFP-C2-NLRC5组明显表现与沉默组相反的结果。3.NLRC5对LX-2细胞增殖、周期及凋亡的的影响进一步我们利用NLRC5-si RNA预处理LX-2细胞,加入TGF-β1诱导24 h后,MTT方法检测结果表明,与正常LX-2细胞比较,NLRC5-si RNA预处理组LX-2细胞的增殖明显受到抑制;流式细胞仪检测显示,NLRC5-si RNA预处理组LX-2细胞的凋亡明显提高,进一步筛选相关凋亡蛋白,结果发现DR4、DR5、Caspase-3凋亡蛋白表达量升高。4.NLRC5对NF-κB和TGF-?1/Smad信号通路的调控作用首先我们研究NLRC5对NF-κB信号通路的调控作用,在TGF-β1诱导后LX-2细胞中,荧光素酶实验结果证实NF-κB通路被NLRC5负调控。通过提取胞浆蛋白和核蛋白,Western blot结果显示NLRC5-si RNA转染到LX-2细胞内,核内P65的蛋白表达量相较于对照组明显升高,且免疫染色可观察到相应结果。进一步使用NF-κB特异性抑制剂PDTC后,可发现NLRC5表达量较于TGF-?1组明显降低,提示NF-κB通路可以产生NLRC5,NLRC5与NF-κB信号通路可以形成一个负反馈循环。其次我们研究TNF-α诱导LX-2细胞分泌炎症因子时,NLRC5对NF-κB通路的调控作用,结果发现,在TNF-α诱导LX-2细胞中,NF-κB信号通路明显升高。LipofectamineTM2000转染NLRC5-si RNA到TNF-α诱导的LX-2细胞内,可明显激活NF-κB通路;Western blot实验结果证实NF-κB通路被NLRC5负调控。实验进一步检测NLRC5对TGF-?1/Smad通路的调控作用,结果发现在TGF-β1诱导后LX-2细胞中,沉默NLRC5后可以抑制p-Smad2,p-Smad3的表达,相较于对照组具有统计学意义。提示NLRC5调节炎症因子分泌时,其功能与NF-κB信号通路有关。而在肝纤维化作用时NLRC5可以负向调控NF-κB通路,同时正向调控TGF-?1/Smad通路。