功能性多肽自组装纳米纤维水凝胶诱导骨髓间充质干细胞向神经元分化研究

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目的:设计一种含IKVAV/RGD功能性多肽自组装水凝胶与骨髓间充质干细胞共培养,观察细胞生长状态、细胞相容性、细胞粘附性能及向神经元细胞分化情况。方法:1.取3-4周龄SD(Sprague Dawley)大鼠采用全骨髓贴壁法分离、培养BMSCs(骨髓间充质干细胞)并用流式细胞术鉴定BMSCs表面抗原。2.设计含IKVAV(I-异亮氨酸,K-赖氨酸,V-缬氨酸,A-丙氨酸,V-缬氨酸)/RGD(R-精氨酸,G-甘氨酸,D-天冬氨酸)多肽用固相自动多肽合成仪(Solid-phase peptid synthesis,SPPS)合成,采用HPLC(高效液相色谱)纯化并检测其纯度,质谱(MS)仪检测其平均分子量。配制成1wt%含IKVAV/RGD两亲性多肽溶液用等剂量DMEM触发自组装水凝胶形成,并用透射电镜显微(TEM)观察自组装水凝胶内部结构。3.CCK-8试剂盒检测不同浓度的含IKVAV-RGD自组装水凝胶与BMSCs共培养细胞增殖/毒性实验;死活细胞染色检测试剂Calcein-AM/PI分别检测含IKVAV-RGD自组装多肽水凝胶与BMSCs共培养(三维体系培养)、骨髓间充质干细胞接种于PLL(多赖氨基酸)包被的盖波片表面(二维体系培养)下的细胞生长情况;随后将实验分为三组:IKVAV/RGD组、IKVAV组、PLL(多聚赖氨酸)组,经7天共培养后,细胞免疫荧光检测细胞分化后的MAP-2、GFAP相关蛋白表达量,另外检测了IKVAV-RGD对细胞粘附性能。结果:1.分离获取的第三代BMSCs呈梭形状,流式细胞测定显示细胞高表达CD105阳性和CD45阴性为90.88%,而CD 90阳性和CD 34阴性的比例为94.14%。2.两亲性多肽设计序列:RGDK-\IKVAVAK-/KGGGGAAAAK-C16H31O,高效液相色谱(HPLC)纯化并检测多肽纯度为95%,MS测得合成含IKVAV-RGD两亲性肽分子量为M.W.:2191.72,与实际理论分子量相符合。TEM结果示含IKVAV-RGD两亲性自组装水凝胶由纳米纤维构成,呈树枝状相互交叉,纳米纤维直径25nm,长度150500 nm;3.酶标仪在450nm波长下测量CCk-8吸光度,对照组A组和实验组BCDE组在1、3、7天都是成增长趋势,E组吸光度比对照组A组略低;1d、3d、7d后分别进行Calcein-AM/PI染色,活细胞与死细胞随着细胞培养时间增加,活细胞数目也显著增加,死细胞无明显差异;接种1000个cell/cm2,2h、4h、6h后清洗,两亲性IKVAV-RGD多肽组粘附性能最强。4.BMSCs接种在IKVAV-RGD水凝胶培育7天后,IKVAV-RGD组比IKVAV组的MAP-2神经元相关表达量较多而星形胶质细胞GFAP的相关表达量下降。结论:1.IKVAV-RGD两亲性多肽可以增加细胞粘附性;2.IKVAV-RGD两亲性多肽比IKVAV两亲性多肽更具有诱导BMSCs向神经元细胞分化的能力。
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