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小菜蛾Plutella xylostella(L.),属鳞翅目菜蛾科,是十字花科作物重要害虫,在世界各地广泛分布。小菜蛾繁殖力强和世代周期短的特点使其能对各种杀虫剂快速进化产生抗药性,这使得小菜蛾的治理问题日趋严重。苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt),属于革兰氏阳性细菌,它在产胞过程中能产生多种杀虫晶体蛋白,对多种靶标害虫具有高效专一的毒杀作用,而且不同的Bt杀虫晶体蛋白基因也被转入到了多种重要的大田作物中(Bt作物),这在控制田间害虫方面起到了不可替代的作用。然而,Bt制剂及Bt作物的大量不合理使用不可避免的导致害虫对Bt产生高抗性。因此,阐明害虫对Bt产生抗性的分子机制对于Bt可持续应用和田间害虫抗性综合治理至关重要。小菜蛾是第一个被报道在田间对Bt制剂产生抗性的害虫,而且小菜蛾全基因组测序也已完成并对外公布,这使得小菜蛾成为研究昆虫对Bt抗药性分子机制的模式昆虫。本实验室前期小菜蛾Bt抗性分子机制研究发现小菜蛾对Bt Cry1Ac抗性与经典的Bt R-1抗性基因座内有丝分裂原激活的蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号途径上游的Px MAP4K4基因转录激活后反式调控多个中肠Cry1Ac抗性基因差异表达相关。这些抗性基因包括位于Bt R-1抗性基因座内的多个ABC转运蛋白基因(Px ABCC1-3)和位于Bt R-1抗性基因座外的碱性磷酸酶基因(Pxm ALP)和ABC转运蛋白基因(Px ABCG1)。然而,MAPK信号途径是一个非常复杂的四级信号级联放大(MAP4K-MAP3K-MAP2K-MAPK)的调控网络,其中具体哪些激酶受到MAP4K4的激活从而参与调控Bt Cry1Ac抗性基因的差异表达目前仍不清楚。在本论文中,我们利用组学、生物化学和分子生物学等多种实验技术对小菜蛾MAPK信号途径及其在Bt Cry1Ac抗性中扮演的重要角色进行进一步的深入研究。通过在全基因组水平上对小菜蛾MAPK信号途径基因进行鉴定和克隆,并对Bt敏感和抗性小菜蛾种群中基因的转录水平差异、蛋白水平差异和蛋白翻译后磷酸化水平的差异进行研究,实验结果表明MAPK信号途径可以通过蛋白磷酸化激活的复杂信号级联和调控网络反式调控多个抗性基因的差异表达,从而导致小菜蛾对Bt Cry1Ac产生高抗性。研究结果对于进一步深入理解MAPK信号途径介导的小菜蛾Cry1Ac抗性分子机制以及害虫Bt抗性田间治理具有重要的理论与实践意义。主要的研究内容和结果如下:1.小菜蛾MAPK信号途径基因注释利用生物信息学技术对小菜蛾基因组数据进行分析,鉴定得到2个MAP4K基因,7个MAP3K基因,4个MAP2K基因和4个MAPK基因,这是小菜蛾MAPK信号途径四级信号级联放大反应过程的基本基因构成。同时对家蚕、烟草天蛾、帝王蝶、豌豆长管蚜、长虹锥蝽、赤拟谷盗、西方蜜蜂、丽蝇蛹集金小蜂、体虱、二斑叶螨这10个节肢动物基因组中的MAPK信号途径基因进行注释分析。通过对不同节肢动物中MAPK信号途径激酶类别的分布、进化关系和选择压进行分析后发现MAPK信号途径基因构成复杂但在不同物种间进化保守。2.小菜蛾MAPK信号途径基因转录和蛋白水平定量分析利用qPCR对MAPK信号途径基因在5个Bt敏感和抗性小菜蛾种群中的转录水平进行分析,发现大多数MAPK信号途径基因在抗性种群中表达量上调。鉴于MAPK途径主要依赖于磷酸化进行信号的传导和放大,我们随后利用Western Blot对Bt敏抗种群中MAPK信号途径下游p38、JNK和ERK激酶的蛋白水平和蛋白磷酸化水平进行定量分析。实验结果表明,p38、JNK和ERK的蛋白水平在抗性种群中有所升高,而p38、JNK和ERK的磷酸化水平在抗性种群中显著升高。这些结果说明MAPK信号途径在小菜蛾Bt抗性种群中主要是通过蛋白磷酸化水平激活的。3.特异性抑制剂探究MAPK信号途径调控Cry1Ac抗性基因表达通过特异性抑制剂抑制相应MAPK信号途径后检测Cry1Ac抗性基因转录水平表达量变化探究p38、JNK和ERK途径是否参与小菜蛾Bt抗性。实验结果显示,在Px ABCC1和Px ABCC2的调控中,p38途径和ERK途径共同发挥作用;在Px ABCC3的调控中,p38途径发挥主导作用,JNK途径起协同作用;在Pxm ALP的调控中,p38途径发挥主导作用,ERK途径发挥协同作用;在Px ABCG1的调控中,p38途径和JNK途径共同发挥作用。这表明p38、JNK和ERK途径主要通过调控不同抗性基因的表达量参与小菜蛾Cry1Ac抗性。4.磷酸化蛋白质组学分析Bt敏感和抗性种群间蛋白磷酸化水平差异利用磷酸化蛋白质组学技术分析敏感种群和Cry1Ac高抗近等基因系种群中肠蛋白磷酸化水平差异,从而在组学水平进一步研究MAPK信号途径和其他相关蛋白在敏抗种群中磷酸化差异。研究发现MAPK信号途径中MAP3K7,TAO,MAP2K6,p38和ERK磷酸化水平在抗性种群中显著升高,而与MAPK信号途径相关的磷酸酶PP1(protein phosphatase 1)、DUSP13(dual specificity protein phosphatase 13)和scaffold蛋白JIP3(JNK-interacting protein 3)的蛋白磷酸化水平在抗性种群中也发生了显著性变化。此外,细胞膜或细胞器膜上的多种功能受体也在蛋白磷酸化水平发生了显著性变化,如ABC转运蛋白中ABCC和ABCG家族以及氨基酸转运蛋白等。这表明MAPK信号途径蛋白磷酸化水平差异与小菜蛾Cry1Ac抗性密切相关。5.MAPK信号途径基因的RNAi功能验证利用RNAi技术沉默MAPK信号途径相关基因表达后检测抗性基因表达量变化,从而揭示参与抗性基因差异表达调控的MAPK信号途径激酶基因。研究发现Raf-MAP2K1-ERK构成的ERK途径和MAP2K6-p38构成的p38途径均可参与Cry1Ac抗性基因的调控;而MAP3K7可以通过p38和JNK参与调控抗性基因的表达;MAP4K4可以通过p38、JNK和ERK调控抗性基因。实验结果阐明了MAPK信号途径如何通过四级信号级联放大反应调控Cry1Ac抗性基因的差异表达。总之,通过上述一系列的实验研究解析了小菜蛾MAPK信号途径的基因构成,明确了MAPK信号途径可以通过反式调控抗性基因的差异表达参与小菜蛾Bt Cry1Ac的抗性,从而进一步揭示了小菜蛾中MAPK信号途径反式调控介导的Bt Cry1Ac抗性分子机制。