研究背景:原发性免疫性血小板减少症(Primary immune thrombocytopenia,ITP),发病机制为抗体介导的血小板破坏和/或生成受损。临床表现主要为血小板计数有不同程度减少,大部分ITP患者骨髓巨核细胞数量正常或增加。目前的治疗方案包括糖皮质激素、静脉注射免疫球蛋白、脾切除术、血小板生成素受体激动剂、抗CD20单克隆抗体和其他免疫抑制药物。然而,ITP长期缓解率较低,个体差异较大。因此,探索更进一步的免疫调节疗法意义重大。ITP的发病机制复杂,导致血小板自身抗原免疫失耐受的机制仍不清楚。众多免疫细胞参与到ITP免疫耐受失衡的过程,涉及抗原提呈细胞、T细胞和B细胞之间的相互作用。调节性T细胞(Regulatory T cells,Tregs)作为免疫抑制性T细胞的一个子集,在诱导和维持免疫耐受中起关键作用。许多自身免疫性疾病,与外周血Tregs的数量减少和功能受损有关,可能导致自身反应性效应T细胞过度增殖及功能过强。许多研究表明,活动期ITP患者Tregs异常,导致ITP患者自身免疫失耐受。此外,本实验室以前的工作表明,单核/巨噬细胞通过膜表面的Fcγ受体识别经自身抗体致敏的血小板,介导血小板的吞噬作用。相较于健康对照者,初诊ITP患者外周血中单核细胞显示出更强的Fcγ受体介导的吞噬能力。临床和实验研究均显示地塞米松等治疗可部分通过调节Tregs的活化,以及减少单核/巨噬细胞的吞噬作用发挥治疗效果。18β-甘草次酸(18β-glycyrrhetinic acid,18β-GA)是甘草酸的主要活性成分,可通过调节T细胞亚群的稳态来实现甘草酸的大部分药理特性。18β-GA具有多种生化和药理活性,包括免疫调节和抗炎活性。此外,18β-GA也是一种新型的HMGB1药理抑制剂,可直接与HMGB1结合,抑制其细胞因子活性。目前,市面上已有含18β-GA的各种剂型,且在临床上广泛使用。高迁移率族蛋白B1(High mobility group box 1,HMGB1)是一种非组蛋白核蛋白,不仅在细胞内起着DNA分子伴侣的作用,而且在细胞外也发挥了损伤相关分子模式(Damage associated molecular pattern,DAMP)分子的作用。HMGB1首先被鉴定为晚期炎症介质,其升高程度与疾病进展相关,随后发现它可以介导自身免疫性疾病的发展,作用于细胞表面受体并触发细胞内信号传导。在乙型肝炎,炎症性肠病,系统性红斑狼疮,类风湿性关节炎等自身免疫性疾病中,血清和关节滑膜中HMGB1的表达增加,并伴有IL-6和IL-17等促炎因子增加,影响Th1/Th2和Th17/Tregs的平衡。HMGB1刺激可致小鼠和人类Foxp3的表达下调,且降低Tregs分泌IL-10的水平。研究表明,ITP患者的脾脏和血清中HMGB1水平高于健康对照组。鉴于18β-GA是一种可以直接与HMGB1结合的抑制剂,目前尚不清楚18β-GA是否具有恢复ITP疾病中免疫耐受的潜力,关于HMGB1和18β-GA在ITP患者中的作用尚需进一步研究。研究目的:本研究旨在评估18β-GA是否能减轻ITP小鼠模型及患者的症状并恢复其免疫耐受性。通过体内和体外实验,研究18β-GA调节Tregs和单核/巨噬细胞的作用及其潜在的分子机制。进行前瞻性队列研究,以评估18β-GA在ITP患者中的疗效和安全性。为将来ITP的治疗提供新思路。研究方法:1.ITP小鼠主动模型收集野生型(WT)C57/BL6小鼠的血小板,向C57/BL6CD61-KO小鼠输注108/100μl,每周一次,连续四周,实施安乐死并获取其脾脏,制成单细胞悬液。对同背景的严重联合免疫缺陷(Severe combined immunodeficient,SCID)小鼠进行180cGy的全身照射,3小时内将制备的免疫脾胞制剂(5×104/小鼠)通过腹腔注射给SCID小鼠,建立主动型ITP小鼠模型。18β-GA组小鼠腹腔注射18β-GA(30mg/kg,3%DMSO),对照组接受相同体积的3%DMSO,每两天一次。5周后对ITP小鼠实施安乐死。取外周血,脾脏,胸腺,腹股沟淋巴结和肝脏。1.1每周使用全血细胞仪监测血小板数(1/10稀释后),及体重。1.2 5 周 后,活 体 成 像:DIR(1,1’-Dioctadecyl-3,3,3’,3’-Tetramethylindotricarbocyanine Iodide)标记的WT小鼠血小板注入两组ITP小鼠中,30分钟安乐死小鼠,摘除脾脏和肝脏。使用体内成像系统测量荧光强度,来评估器官中血小板潴留情况。1.3 5周后,流式细胞术检测小鼠各器官中CD4+CD25+Foxp3+Tregs,CD11b+CD115+Ly6c+单核细胞,和 M1型 F4/80+CD80+CD86+巨噬细胞比例。2.前瞻性临床队列研究的评估从2019年6月到2019年9月,招募并筛选了 34例原发性ITP且未接受过治疗的患者。16位患者接受18β-GA(75mg,每天3次×7天)和地塞米松(Dexamethasone,DXM;40mg,每天1次×4天)治疗;18名患者单独使用地塞米松治疗(DXM;40mg,每天1次×4天)。主要终点为完全缓解(CR),缓解(R)和总体缓解(OR)。次要终点是反应时间和不良事件。干预后每周评估治疗反应。该研究在ClinicalTrials.gov上注册(#NCT03998982)。3.患者及标本2017年12月至2019年3月,本实验纳入40例ITP患者,并按年龄匹配20位健康志愿者。收集EDTA-抗凝采血管静脉血5mL,分离外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),并使用抗体包被的磁珠和 MS 柱,分选CD4+T细胞,naive CD4+T细胞,以及CD14+单核细胞。3.1体外细胞实验:PBMCs,CD4+T细胞培养基中加入重组人IL-2(10ng/mL),抗人CD3抗体(1μg/mL),以及抗人CD28抗体(1μg/mL),naive+CD4+T细胞培养基中还需补充抗TGFβ1抗体(5ng/ml)。用一系列浓度(12.5μM/25μM/50μM/100μM)的 18β-GA或重组人 HMGB1 蛋白(Recombinant human HMGB1,rhHMGB1,100ng/mL)培养细胞,0.1%DMSO作为对照。孵育数小时后,收集细胞用于流式细胞术,免疫荧光,RT-PCR和Western blot检测。3.1.1 流式细胞术以及免疫荧光,检测巨噬细胞的吞噬功能:抗CD14磁珠分选单核细胞,加入18β-GA/DMSO,PMA刺激过夜,巨噬细胞与抗CD41抗体包被的 CMFDA(5-chloromethylfluorescein diacetate)标记的血小板(1:10)共孵育1小时,流式细胞术及免疫荧光,测定巨噬细胞吞噬的血小板的平均荧光强度。3.1.2 流式细胞术Annexin V和PI染色,检测18β-GA使用前后PBMCs凋亡水平。3.1.3 流式细胞术检测 PBMCs/CD4+T cells/naive CD4+T cells各细胞群中,18β-GA使用前后以及rhHMGB1阻断前后,+D4+CD25+Foxp3+Tregs比例;酶联免疫标记法(Enzyme linked immunoabsorbent assay,ELISA)检测细胞上清液中HMGB1的含量;荧光定量PCR检测Foxp3的表达水平。3.1.4 Tregs抑制功能检测:磁珠分离CD4+CD25-效应T细胞(Teffs),加入CFSE 染色后,按照 2×105/孔种于圆底 96 孔板。磁珠分离CD4+CD+5+Fox+3+Tregs细胞,按照与Teffs细胞的比例为1:4加入圆底96孔板共培养。6天后流式检测,18β-GA使用前后,CD4+Teffs细胞增殖代数。3.2比较ITP患者与健康对照者HMGB1差异,评估HMGB1的临床诊断价值。3.2.1 ELISA法检测ITP患者和健康对照者血浆HMGB1的表达水平;对患者血常规中血小板计数与血浆HMGB1水平进行相关性分析;ROC曲线下面积(AUC)分析HMGB1作为ITP辅助诊断指标的特异度和灵敏度。3.2.2 ELISA及Western blot检测ITP患者和健康对照者PBMCs/CD4+T细胞中HMGB1的表达水平。实验结果:1.18β-GA改善主动型小鼠模型的血小板减少症。1.1血小板计数与体重:造模第14天时血小板计数降至最低点,在第28天,与对照组相比,18β-GA治疗组中观察到明显更高的血小板计数(**P28=0.0017,**P35=0.0012)。18β-GA对ITP小鼠的体重没有显着影响。1.2肝脏和脾脏中血小板驻留:35天后,ITP小鼠尾静脉注射DIR标记的血小板,30分钟后安乐死并取出肝脏和脾脏,体内成像系统评估血小板残留。得出,18β-GA治疗后,与对照组相比,肝脏和脾脏的血小板吞噬作用减弱(**P肝=0.0051,P脾=0.1212)。1.3各器官Tregs/单核细胞/巨噬细胞比例:35天后,流式结果显示,与对照组相比,18β-GA治疗可增加小鼠脾脏、腹股沟淋巴结和胸腺的CD4+CD25+F+xp3+Tregs 比例;减少外周血和脾脏中CD11b+CD115+Ly6c+单核细胞的百分比;减少脾脏和肝脏中的F4/80+CD80+CD86+M1型巨噬细胞比例。2.前瞻性队列分析,在ITP患者中DXM联合18β-GA的临床反应优于单独使用DXM的治疗。2.1 DXM 组(n=18)的 OR(CR/R)比率为 50%(9/18),DXM+18β-GA 组(n=16)为62.5%(10/16),并且未观察到明显的不良事件。2.2在两组均达到CR/R的患者中,与治疗前相比,治疗后血小板计数显着增加;两组NR患者血小板减少的症状也得到改善,血小板计数也显著增加。2.3 △platelets定义为治疗前后一名患者的血小板计数变化。与单独使用DXM相比,用 DXM+18β-GA 治疗后 △platelets 显着增加,DXM 组为 19(-1,211)× 109/L,而 DXM+18β-GA 组为 71(7,268)×109/L(*P=0.0433)。3.18β-GA减轻了 ITP患者巨噬细胞对血小板的吞噬作用。3.1流式细胞术结果显示,与对照组(0.1%DMSO)组相比,18β-GA可以降低巨噬细胞对血小板的吞噬作用。(**P=0.0067)。3.2免疫荧光图像显示,18β-GA组巨噬细胞吞噬的血小板数量少于对照组。4.18β-GA对ITP患者及健康对照者PBMCs中Tregs比例的增加具有一定的浓度依赖性。流式细胞术以及PCR结果显示:剂量为25μM和50μM时,18β-GA均可增加Tregs的数量,然而在25μM时PBMCs中CD4+T细胞的百分比没有变化;18β-GA组的Foxp3 mRNA表达量高于对照组;随着浓度的增加,在50μM和100μM的高剂量下可诱导ITP患者PMBCs凋亡。因此本实验选取25μM作为18β-GA最佳剂量。5.18β-GA增加了 naive CD4+T细胞向Tregs的分化,并增强了其抑制功能。5.1我们从ITP患者的PBMC中磁珠分选出CD4+T细胞,流式结果显示,25μM 18β-GA可以增加Tregs的数量,分选naiveCD4+T细胞,重复实验,结果表明18β-G可以刺激naiveCD4+T细胞向Tregs的分化和活化。5.2 18β-GA增强Tregs的抑制功能:我们将CFSE标记的效应T细胞(CD4+CD25-Teffs)与 CD4+CD25+Foxp3+Tregs 以 4:1 的比例共培养 5 天。流式细胞术结果显示,在18β-GA组和对照组中,Tregs均显着抑制效应T细胞的增殖。与对照组相比,18β-GA可以显着增强Tregs的抑制功能。18β-GA本身对效应T细胞的增殖没有明显影响,表明18β-GA可以增强Tregs抑制效应T细胞增殖的功能。6.18β-GA通过作用于CD4+T细胞,抑制HMGB1功能,从而增加Tregs比例。6.1 ELISA和RT-PCR结果显示,活动期ITP患者的血浆中HMGBI的表达水平以及PBMCs中HMGB1的mRNA表达均高于健康对照组。6.2在ITP患者的血常规检查中发现,血浆HMGB1水平与血小板计数呈负相关(r=-0.7602,R2=0.5778,*P=0.0174)。由此推断,HMGB1 有助于 ITP 诊断,并可用于确定疾病严重程度。6.3使用ROC曲线下面积(AUC)分析,确定血浆HMGB1对ITP具有诊断价值:HMGB1 的 AUC 为 0.751(0.5843-0.9176,*P=0.0194),其最佳敏感性和特异性分别为90.91%和69.57%。6.4 ELISA和western blot结果显示,CD4+T细胞可以直接产生HMGB1,且与健康对照组相比,ITP患者CD4+T细胞HMGB1表达水平更高。6.5拯救实验,流式结果证明18β-GA在ITP中的作用与HMGB1功能的抑制有关:ITP患者中,与DMSO组相比,18β-GA增加了 CD4+T细胞中Tregs的产生(18β-GA 与 DMSO 相比,****P<0.0001)。加用 100ng/ml 的 rhHMGB1,这种变化明显减弱(18β-GA 与 rHMGB1+18β-GA 相比,**P=0.0028)。HMGB1 本身直接减少Tregs的数量(DMSO与rHMGB1相比,***P<0.0001),当加用18β-GA 时这种抑制作用减弱(rHMGB1 与 rHMGB1+18β-GA,****P<0.001)。实验结论:在这项研究中,我们通过体内和体外实验评估了 18β-GA是否可以恢复ITP的免疫耐受性。体内实验证明18β-GA可以恢复ITP小鼠的血小板计数。体外实验证明18β-GA刺激了 Tregs的产生,并通过调节HMGB1的功能恢复Tregs的抑制作用,且18β-GA可以在体内和体外减弱单核巨噬系统对血小板的吞噬作用。一项队列研究表明,18β-GA联合DXM治疗对ITP患者是安全有效的。因此,我们认为18β-GA可以作为治疗ITP患者的潜在药物。