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酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)是因长期、大量饮用乙醇所致肝脏的损害性病变,在组织病理学上主要表现为三种形式:酒精性脂肪肝、酒精性肝炎和肝纤维化,这三种形式可单独或混和存在。酒精性脂肪肝(Alcoholic fatty liver,AFL)是ALD早期阶段,进一步发展为肝纤维化和肝硬化的危险性比单纯性脂肪肝高。AFL的发病机制可能与乙醇及其代谢产物对肝脏的损伤以及脂质过氧化损伤有关,酒精本身具有热量,长期大量摄入,容易造成能量堆积,营养失衡,酒精不仅损害脂肪氧化,也可刺激脂肪形成,引起脂质代谢紊乱。 豹皮樟,又名老鹰茶,系樟科木姜子属毛豺皮樟(Litsea Coreana level)的嫩梢和叶片,是我国南方各民族民间长期饮用的一种植物代用茶,具有清凉止渴、解毒消肿、明目健胃等功效。老鹰茶中含有多种活性成分,经我院天然药物化学教研室提取分离鉴定,确定了豹皮樟的有效部位为总黄酮(Total flavonoids),总黄酮含量超过51.5％。前期研究发现豹皮樟总黄酮(Total Flavonoids of Litsea Coreana Level,TFLC)具有显著的抗炎免疫、降糖、调血脂作用和抗肝纤维化等作用。 本研究以生理途径摄入酒精建立AFL大鼠模型,肝脏灌流获得原代肝细胞,观察TFLC对AFL大鼠和AFL大鼠肝细胞的防治作用并探讨其作用机制。具体内容概括如下: 1、TFLC对AFL大鼠防治作用 生理途径摄入酒精制备AFL大鼠模型,设置正常组,AFL模型组,TFLC(100,200,400mg/kg)组,阳性药谷胱甘肽(Glutathion,GSH)组,另设蔗糖对照组。第7周开始给药,连续6周。测定血清中ALT、AST水平,肝匀浆中MDA、SOD和GSHpx水平,HE染色、苏丹III染色以及透射电镜方法观察大鼠肝脏病理形态学的改变。结果显示:与模型组比较,TFLC用药后可改善大鼠一般状况,减轻明显增加的肝脏指数,降低AFL大鼠血清过高的ALT、AST水平,降低肝脏升高的MDA水平,同时使其降低的SOD和GSHpx水平有所恢复。病理检查结果显示,与AFL模型组比较,TFLC组大鼠肝脏脂肪变性和炎症明显减轻。TFLC对大鼠AFL的形成具有防治作用,可能与其抗脂质过氧化的作用有关。 2、TFLC对AFL大鼠血糖、血脂以及脂肪细胞因子和胰岛素抵抗的作用 造模第7周开始,TFLC ig连续6周。与AFL模型组比较,TFLC能明显降低大鼠血清TG、TC、FFA和LDL-C水平,对低下的HDL-C水平有一定的提升作用,对升高的血糖水平有一定的降低作用。 ELISA法检测血清APOB、TNF-α水平,放射免疫法测定血清中Leptin、Insulin的含量。与模型组相比,TFLC能降低大鼠血清过高瘦素和胰岛素水平,也能降低AFL大鼠血清中增高的TNF-α和APOB水平 RT-PCR法测定AFL大鼠肝脏脂肪细胞因子TNF-α、Leptin mRNA的表达。结果显示,与AFL模型组比较,TFLC可明显降低肝脏TNF-α、Leptin mRNA表达水平。 TFLC可明显改善AFL脂质代谢紊乱状况,与其调节脂肪细胞因子和改善高胰岛素血症的作用有关。 3、TFLC调节AFL大鼠脂质代谢相关指标ADRP、PPARγ和Sir2的作用 脂质代谢相关指标ADRP、PPARγ和Sir2在AFL发生发展中其重要作用。RT-PCR和Western blotting检测AFL大鼠肝脏ADRP、PPARγ和Sir2的表达。以β-actin作为内标,TFLC用药后ADRP、PPARγ蛋白和mRNA表达有所下降,Sir2蛋白和PGC-1α、Sir2 mRNA相对含量明显增高。 免疫组化方法检测大鼠肝脏PPARγ和ADRP表达,PPARγ主要表达于细胞的胞浆和胞核,呈黄棕色颗粒;ADRP主要定位于成熟脂肪细胞胞膜上,呈棕黄色颗粒。TFLC用药6周后,与模型组比较,TFLC组大鼠肝脏PPARγ和ADRP表达有不同程度的降低。TFLC对AFL大鼠的保护作用可能与其降血脂,调节AFL大鼠脂质代谢相关指标ADRP、PPARγ和Sir2的作用有关。 4、TFLC对AFL大鼠肝细胞脂质代谢的影响 改良的原位二步Ⅳ胶原酶灌流法分离获得AFL大鼠原代肝细胞,SP染色的CK18鉴定肝细胞,胎盼蓝染色观察细胞活性大于80%。肝细胞分为正常组,AFL模型组,TFLC(1,10,100mg/L),GSH组以及Nic组。肝细胞培养16h,TFLC或GSH或Nic与肝细胞共培养48h,MTT测定TFLC对肝细胞的增殖能力的影响。免疫组化和RT-PCR方法测定ADRP、PPARγ的蛋白和mRNA表达,Western Blot检测Sir2蛋白表达。TFLC用药后可明显改善体外培养的AFL肝细胞的增殖能力,减少ADRP以及PPARγ阳性表达的细胞数和表达量,增加AFL肝细胞Sir2蛋白和mRNA表达。 以上实验结果表明,整体动物和细胞水平研究发现,TFLC可明显大鼠减轻肝脏脂肪变性和炎症,具有降血糖,降血脂,调节脂肪细胞因子和改善高胰岛素血症的作用。能够降低ADRP和PPARγ表达,增加PGC-1α和Sir2相对含量,作用机制可能与TFLC的抗炎、抗脂质过氧化、改善脂质代谢紊乱以及调节ADRP、PPARγ和Sir2等脂质代谢相关指标等的作用有关。