DAZL是高度保守的DAZ(Deleted in Azoospermia)家族成员之一,定位于脊椎动物的常染色体,在PGC发育迁移、精原细胞分化、减数分裂起始及发展等过程中起重要作用,人DAZL蛋白可以促进胚胎干细胞分化为精子,是配子生成的重要调控因子。DAZL同源基因在从硬骨鱼到人类几乎所有物种的生殖细胞中特定表达,其表达持续存在于胚胎干细胞(ESCs)直至单倍体圆形精子。是什么机制调控了Daz1高度时空特异性表达?这是我们面临的科学问题,DNA甲基化在内的表观遗传修饰是可能的表达调控机制。精子形成过程中,存在原始生殖细胞甲基化信息广泛擦除和随后生殖细胞甲基化的重新建立,这对保障精子的正常发育起重要作用,异常的表观遗传修饰尤其是DNA甲基化可能是导致男性生精障碍及精子活力下降的机制之一。生精相关基因Daz1启动子甲基化模式异常改变是否与男性生精障碍存在关联?部分生殖特异表达基因在人类体细胞恶性肿瘤中异常激活称为癌-生殖基因,研究生殖特定基因Daz1的表达调控机制以及鉴定癌-生殖基因能够为恶性肿瘤相关基础研究提供帮助。本研究分二部分：一、DNA甲基化参与调控Daz1生殖特异表达及其在物种间进化上的保守性该部分研究首先检测了Daz1在小鼠睾丸和体细胞组织中的表达差异,进而测定Daz1启动子CpG岛在不同组织类型中的甲基化模式,分析小鼠Daz1启动子甲基化模式与Daz1特定表达的关系；进一步研究了解小鼠精子发生不同阶段中Daz1表达是否和其甲基化模式存在关联；在体细胞系(NIH3T3)中采用5-氮杂-2’-脱氧胞苷处理去甲基化后检测Daz1表达情况；在其他哺乳动物和脊椎动物中选取不同物种进行研究,了解Daz1转录调控机制在进化上的保守性;设定计算法对Daz1启动子区域进行生物信息学分析,预测可能的转录因子结合位点。通过以上实验力图阐明Daz1生殖特异表达的转录调控机制。成果如下：1.小鼠Daz1基因表达存在时空特异性通过qRT-PCR方法检测Daz1在成年雄性小鼠睾丸、肝脏、心脏、肠管、脾脏、肌肉、肾脏、胸腺、肺及脑组织中的表达。在体细胞组织中没有检测到Daz1mRNA的表达,而在小鼠睾丸中高表达。继续用qRT-PCR方法检测Daz1在生后3天、6天、8天、12天、14天、16天、18天、20天、21天、5周小鼠睾丸中的表达。在不同发育阶段的小鼠睾丸中,Daz1在3日龄小鼠睾丸中检测出表达,于出生后16-18天时达到峰值,其后有所降低。实验室前期进行的小鼠睾丸冰冻切片免疫组化实验表明Daz1在精原细胞、前细线期精母细胞、偶线期精母细胞和早-中粗线期精母细胞中高表达,此后表达渐减少,在圆形精子中有少量表达,于长形精子中未检测到。通过以上研究,表明Daz1基因表达模式具有高度时空特异性。2.小鼠Daz1启动子CpG岛的甲基化模式与基因表达呈现显著负相关我们运用Methyl Primer Expresss V1.0软件对Daz1启动子进行分析,预测出相应区域CpG岛,采用亚硫酸氢盐修饰后测序PCR(Bisulfite sequencing PCR, BSP)法,分别检测不同组织细胞类型Daz1启动子CpG岛的甲基化状态。结果显示：在成年小鼠体细胞组织(肾脏、脑)中Daz1启动子CpG岛高度甲基化,而在睾丸中Daz1启动子CpG岛呈现低甲基化模式,附睾精子中甲基化程度相较睾丸组织更低。Daz1启动子CpG岛的甲基化模式与其表达情况呈现明显的负相关,提示Daz1启动子区域甲基化可能参与了Daz1生殖细胞特异性表达的调控。通过对小鼠出生后不同时间点睾丸中Daz1启动子CpG岛的甲基化检测,我们发现Daz1启动子区域在小鼠6-8日龄以及10-12日龄呈现低甲基化状态,而在出生后20-24天表现为甲基化程度升高,这一结果与小鼠Daz1表达于精原细胞、持续到圆形精子、以及后续阶段的表达降低相一致。以上相关性结果提示DNA甲基化参与调控了小鼠Daz1时间(精子发生阶段)空间(生殖细胞)特异性的表达。3.体细胞中进行去甲基化处理激活Daz1异常表达上述实验显示小鼠Daz1表达与其启动子甲基化状态呈现显著负相关关系,提示DNA甲基化参与调控小鼠Daz1的时空特异表达,那么在Daz1不表达的体细胞中采用药物去甲基化是否能够诱导Daz1异常激活?为此,我们采用甲基化抑制剂5-Aza-CdR在体细胞系进行去甲基化处理,通过qRT-PCR检测5-Aza-CdR处理后Daz1 mRNA的水平。结果显示Daz1在去甲基化处理后的体细胞中表达升高,作为对照的Tex19.1和RHOX2亦异常升高,而DAZ家族另一成员Boule却无明显变化。这一结果提示体细胞中Daz1的表达沉默由其基因启动子甲基化模式调控,而Boule表达调控机制可能更为复杂多元。4.DNA甲基化机制参与调控Daz1生殖特异表达在物种进化上存在高度保守性。实验采用qRT-PCR对收集的人睾丸及体细胞组织(结肠、前列腺、胃、胆囊及脾脏)DAZL mRNA表达水平进行检测,结果显示DAZL mRNA在人睾丸组织中高表达,而在体细胞组织中不表达。进一步研究DAZL启动子甲基化模式是否与此相关,实验提取人睾丸、精子、体细胞组织(前列腺、脾脏)DNA进行甲基化检测,发现在体细胞组织中DAZL启动子为高甲基化状态而在睾丸中显示为低甲基化,精子中显示为更低的甲基化程度。相似的实验结果在另一种哺乳动物猪中同样存在,表明DNA甲基化机制参与调控Daz1生殖特异表达存在于哺乳动物中。鉴于Daz1最早表达于脊椎动物生殖细胞,我们进一步实验了解这一调控机制在进化上是否在更低级别的脊椎动物中存在。我们提取了斑马鱼和莱航鸡性腺及体细胞组织的RNA及基因组DNA,实验结果显示Daz1 mRNA在性腺中高表达而Daz1启动子呈低甲基化状态,体细胞组织中Daz1启动子呈高甲基化而无Daz1 mRNA表达。Daz1同源基因表达从硬骨鱼类开始出现到哺乳动物直至人类,以上实验表明启动子区差异化的甲基化模式参与调控Daz1生殖特异性表达,支持这一调控机制古老并且在物种进化上维持保守性的假说。5. Daz1启动子区转录因子可能结合位点的生物信息学预测分析预测转录因子结合位点是研究基因转录调控的重要组成部分。前述研究明确了Daz1在生殖细胞和体细胞中差异化的甲基化模式和其生殖特异表达密切相关,且这种关联贯穿Daz1整个基因进化历程,表明DNA甲基化调控机制在Daz1基因表达调控中保守存在。那么,Dazl启动子区域是否存在保守的顺式作用元件参与基因的转录调控?我们检索人、小鼠、猪及大鼠Dazl Exonl上游3.5kb的序列,设定计算法检测长度大于7个碱基的保守序列,结果显示在上述物种中共同存在12个由7个核苷酸组成的相同序列,数据库检索发现这些保守存在的相似序列可能是一些转录因子的结合位点。二、DAZL表达调控异常与男性生精障碍及肿瘤相关性研究。1.DAZL启动子异常的甲基化模式与男性生精障碍有关。精子发生过程经历了基因组范围内的去甲基化和重新甲基化过程,男性精子甲基化的研究工作将从表观遗传学角度为男性生精障碍临床诊疗提供帮助。为此,我们比较了正常男性与少弱精子症患者精子DAZL启动子甲基化谱差异。收集精液标本后进行精液常规检查和精子形态测定；采用密度梯度离心法去除体细胞污染,提取精子基因组DNA；亚硫酸氢盐处理后PCR体外扩增并纯化,与pCR2.1载体连接及酶切验证,挑取阳性克隆测序；分析不同样本精子DNA甲基化程度差异。和对照相比,少弱精症患者DAZL启动子甲基化率明显升高,结果存在统计学差异。这一结果提示DAZL启动子区异常的甲基化模式可能与男性生精障碍有关。2.DAZL在部分恶性肿瘤中异常表达。癌-生殖基因或癌-睾丸基因是指一类其抗原蛋白表达于人类多种组织来源恶性肿瘤,而在正常组织中只存在于睾丸、卵巢或胎盘组织。上研究显示Dazl生殖细胞特定表达与其基因调控区甲基化模式差异密切相关,其是否类似于癌-生殖基因在恶性肿瘤中异常表达?我们在TCGA数据库中搜索发现DAZL在头颈部肿瘤、肺癌和乳腺癌中表达,尤其在后者中表达较明显。但和其他经典癌-生殖基因相比,DAZL在肿瘤中表达量仍较低,提示DAZL在部分肿瘤中异常表达可能和肿瘤细胞基因组整体异常低甲基化有关。