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盐、碱胁迫作为作物主要的非生物胁迫因素之一，其危害已影响到世界上约20%的可用耕地，严重制约着农作物生产和生态环境建设。大豆是人类饮食、动物饲料和生物柴油的重要经济作物，其蛋白质和油脂含量较高。而盐胁迫能够通过影响基因表达及染色质状态的表观遗传修饰，影响植物的生长和发育。目前，对大豆根系应激反应的表观遗传调控还知之甚少，本研究通过盐、碱处理苗期耐盐碱野生大豆(G.soja)ZYD01922和盐碱敏感大豆(G.max)Williams82，结合MSAP、RNA-seq和ChIP-seq测序技术，从表观遗传学层面和转录组层面探讨了大豆苗期耐盐、碱机理。利用RNA-Seq和ChIP-Seq技术研究了盐胁迫下栽培大豆材料根系转录组和组蛋白甲基化变化模式。主要研究结果如下：
(1)DNA甲基化对受环境影响的基因表达和植物发育具有一定的调节作用。利用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)方法分别比较分析了对照和碱处理条件下野生材料ZYD01922和栽培材料Williams82幼苗根部DNA甲基化状态在处理前后发生的类型变化和程度，共获得4种类型MSAP谱带模式。相对于对照材料，在碱胁迫条件下，野生耐盐碱材料ZYD01922的DNA甲基化(II型+III型+Ⅳ型带)和半甲基化程度下降，全甲基化率和非甲基化率增加；盐敏感材料Williams82的DNA甲基化(II型+III型+Ⅳ型带)程度、全甲基化比率和半甲基化比率表现为增加，而非甲基化率则从22.49%下降至10.84%。与对照相比，Williams82和ZYD01922两个材料分别约有41.77%和60.24%的CCGG位点甲基化状态保持不变，去甲基化条带的比率分别为22.89%和28.11%，甲基化条带比率分别为35.34%和27.71%。随机选择了11个差异性DNA甲基化条带进行了测序分析，BLAST结果表明有5个片段与抗病基因、激素调控、PRA1蛋白家族、过氧化氢酶途径等基因同源。利用qRT-PCR对4个位于CDS区域的MSAP多态性基因进行进一步表达验证，对于ZYD01922来说，S2、S10和S11的基因表达变化为上调表达，S4表现为下调表达。初步证明了基因的去甲基化变化是植物快速响应碱胁迫的表观响应。
(2)结合RNA-seq测序技术分析了Williams82盐胁迫下应答基因的差异表达变化。总计分析了44346个基因，在这些基因中，8798(19.9%)个为差异表达基因，其中4646个基因上调表达，4152个基因下调表达。上调基因涉及转录调节、应激反应、防御反应调节和组蛋白甲基化，而下调基因主要在代谢过程中富集。进一步分析受盐胁迫调节的基因发现在这些基因中，有93个与盐胁迫反应密切相关，其中53个基因上调表达，40个基因下调表达。转录组分析得出，在盐胁迫中，有513个转录因子上调表达，491个转录因子被下调表达。在差异表达的与盐胁迫有关的10个转录因子中，8个是MYB家族，可调节植物对盐胁迫作出反应。
(3)表观修饰不仅可以发生在DNA上，还可以发生在组蛋白上。组蛋白修饰如何调控大豆对盐胁迫的反应报道更为少见。本研究利用ChIP-seq测序方法，分析了组蛋白H3K27me3在大豆Williams82盐胁迫前后的变化趋势。结果显示，组蛋白H3K27me3对调控盐胁迫下基因的表达起到重要作用，H3K27me3类型差异表达的变化呈现出一定的动态规律。H3K27me3在大豆中主要富集在基因转录起始和终止区域，且在基因区低富集。在盐胁迫下，大多数基因的失活与启动子或编码区不同部位H3K27me3的从头甲基化密切相关。对照组大豆幼根1707个受H3K27me3标记基因中(K27基因)，在盐处理和对照条件下，共有878(51%)个表达基因在H3K27上被三甲基化，盐处理组的336个K27基因中有170个(50.6%)上调表达并与H3K27me3去甲基化有关。盐处理组746个H3K27me3标记基因中，有651个基因进行了H3K27me3从头甲基化标记，其中有294个基因同时获得了RNA测序分析表达数据。H3K27me3水平增加与转录下调之间关系的统计试验明，33.7%下调基因(p值=1.9x10-31)的H3K27me3水平有所增加。表明组蛋白甲基化修饰与大豆根中盐诱导基因的激活或失活有关，说明植物通过染色质动态调节、基因激活与失活调控从而应对外界环境胁迫。
此外，研究发现盐处理后9个与拟南芥同源的大豆组蛋白甲基转移酶基因被下调表达，2个基因被上调表达。同时发现3个JmjC蛋白下调表达，1个上调表达。其中2个下调表达基因Glyma.04G192000和Glyma.20G181000与拟南芥已知的组蛋白去甲基化酶ArabidopsisEarlyflowering6(REF6)和RelativeofELF6(ELF6)同源。
拟南芥转基因验证结果表明，大豆Glyma.17G022500基因在拟南芥中的过表达增强了拟南芥耐盐性。由此推测盐胁迫下，大豆组蛋白修饰剂可能参与从头甲基化及基因沉默等进程。
(1)DNA甲基化对受环境影响的基因表达和植物发育具有一定的调节作用。利用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)方法分别比较分析了对照和碱处理条件下野生材料ZYD01922和栽培材料Williams82幼苗根部DNA甲基化状态在处理前后发生的类型变化和程度，共获得4种类型MSAP谱带模式。相对于对照材料，在碱胁迫条件下，野生耐盐碱材料ZYD01922的DNA甲基化(II型+III型+Ⅳ型带)和半甲基化程度下降，全甲基化率和非甲基化率增加；盐敏感材料Williams82的DNA甲基化(II型+III型+Ⅳ型带)程度、全甲基化比率和半甲基化比率表现为增加，而非甲基化率则从22.49%下降至10.84%。与对照相比，Williams82和ZYD01922两个材料分别约有41.77%和60.24%的CCGG位点甲基化状态保持不变，去甲基化条带的比率分别为22.89%和28.11%，甲基化条带比率分别为35.34%和27.71%。随机选择了11个差异性DNA甲基化条带进行了测序分析，BLAST结果表明有5个片段与抗病基因、激素调控、PRA1蛋白家族、过氧化氢酶途径等基因同源。利用qRT-PCR对4个位于CDS区域的MSAP多态性基因进行进一步表达验证，对于ZYD01922来说，S2、S10和S11的基因表达变化为上调表达，S4表现为下调表达。初步证明了基因的去甲基化变化是植物快速响应碱胁迫的表观响应。
(2)结合RNA-seq测序技术分析了Williams82盐胁迫下应答基因的差异表达变化。总计分析了44346个基因，在这些基因中，8798(19.9%)个为差异表达基因，其中4646个基因上调表达，4152个基因下调表达。上调基因涉及转录调节、应激反应、防御反应调节和组蛋白甲基化，而下调基因主要在代谢过程中富集。进一步分析受盐胁迫调节的基因发现在这些基因中，有93个与盐胁迫反应密切相关，其中53个基因上调表达，40个基因下调表达。转录组分析得出，在盐胁迫中，有513个转录因子上调表达，491个转录因子被下调表达。在差异表达的与盐胁迫有关的10个转录因子中，8个是MYB家族，可调节植物对盐胁迫作出反应。
(3)表观修饰不仅可以发生在DNA上，还可以发生在组蛋白上。组蛋白修饰如何调控大豆对盐胁迫的反应报道更为少见。本研究利用ChIP-seq测序方法，分析了组蛋白H3K27me3在大豆Williams82盐胁迫前后的变化趋势。结果显示，组蛋白H3K27me3对调控盐胁迫下基因的表达起到重要作用，H3K27me3类型差异表达的变化呈现出一定的动态规律。H3K27me3在大豆中主要富集在基因转录起始和终止区域，且在基因区低富集。在盐胁迫下，大多数基因的失活与启动子或编码区不同部位H3K27me3的从头甲基化密切相关。对照组大豆幼根1707个受H3K27me3标记基因中(K27基因)，在盐处理和对照条件下，共有878(51%)个表达基因在H3K27上被三甲基化，盐处理组的336个K27基因中有170个(50.6%)上调表达并与H3K27me3去甲基化有关。盐处理组746个H3K27me3标记基因中，有651个基因进行了H3K27me3从头甲基化标记，其中有294个基因同时获得了RNA测序分析表达数据。H3K27me3水平增加与转录下调之间关系的统计试验明，33.7%下调基因(p值=1.9x10-31)的H3K27me3水平有所增加。表明组蛋白甲基化修饰与大豆根中盐诱导基因的激活或失活有关，说明植物通过染色质动态调节、基因激活与失活调控从而应对外界环境胁迫。
此外，研究发现盐处理后9个与拟南芥同源的大豆组蛋白甲基转移酶基因被下调表达，2个基因被上调表达。同时发现3个JmjC蛋白下调表达，1个上调表达。其中2个下调表达基因Glyma.04G192000和Glyma.20G181000与拟南芥已知的组蛋白去甲基化酶ArabidopsisEarlyflowering6(REF6)和RelativeofELF6(ELF6)同源。
拟南芥转基因验证结果表明，大豆Glyma.17G022500基因在拟南芥中的过表达增强了拟南芥耐盐性。由此推测盐胁迫下，大豆组蛋白修饰剂可能参与从头甲基化及基因沉默等进程。