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水稻是世界上最重要的粮食作物之一,也是植物基因组研究的模式植物。在前期研究的基础上,通过检索NCBI网站的水稻基因组数据库,找到水稻硝酸还原酶(NR)和亚硝还原酶基因(NIR)的cDNA序列(登陆号分别为:BM929252和BM929254)。用cDNA序列在NCBI进行BLAST分析,检索到NR和NIR基因的DNA序列(登陆号分别为:NC_008401和NC_008395)。通过PCR方法从水稻基因组中成功克隆到受硝酸盐诱导的NR和NIR基因5上游启动子序列,分别长1379bp(NR)和1265bp(NIR),与GeneBank报道序列相比较,同源性均高达99%。用Plant CARE作顺式作用元件分析,发现两段启动子序列含有多个与转录调控有关的保守序列(如TATA-box、CAAT-box和GAGA-box)。
分别用NR和NIR基因启动子片段取代pCAMBIA3301上的lacZ基因和CaMV35S启动子,构建了含GUS基因的植物双元表达载体:pCAMBIA3301-NR和pCAMBIA3301-NIR。主要用于NR和NIR基因功能的鉴定。构建完成的植物双元表达载体通过农杆菌介导的方法转化水稻愈伤组织,通过瞬时表达检测GUS基因活性,分析启动子的功能。研究表明,NR和NIR基因启动子片段的启动子功能均受硝酸盐诱导。
目前,基因功能及调控外源基因在转基因植物中精确表达等方面的研究成为当前植物基因工程研究的重点,而这些工作的开展主要依靠一个合适的启动子来实现。利用从已知DNA周围未知启动子或其他调控区域中克隆得到的水稻NR和NIR基因的上游区序列,可能是一种具有“开关”活性的可控性启动子。