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第一部分多发性硬化患者血清及法舒地尔处理后对神经元突触的影响目的：了解多发性硬化(Multiple sclerosis, MS)患者血清对神经元突触的影响及Rho激酶抑制剂法舒地尔(Fasudil)的作用。方法：收集63例MS患者血清,36例正常对照血清。首先随机抽取8例MS血清和8例正常血清,采用CycLex(?) Rho-kinase Assay Kit测定血清Rho激酶活性。随后将血清分成单独血清组和血清加Rho激酶抑制剂Fasudil组。单独血清以1：10加入培养第6-7天的原代小鼠皮层神经元,血清加Fasudil组预先在血清中加Fasudil(终浓度15μg/ml培养液)并室温作用1小时,然后加入至培养神经元。神经元继续培养48小时后用MTT法检测细胞活力,测定LDH释放率。4%多聚甲醛固定细胞后,进行MAP-2和Tau染色,荧光显微镜下观察突触生长情况,并测量神经突起长度。取部分固定神经元进行突触标记蛋白Synaptophysin免疫荧光染色,提取的蛋白用Western Blot技术分析Synaptophysin表达。结果：与正常血清相比,MS血清Rho激酶活性增高。MS血清加入至培养神经元后,其神经元细胞活力下降；神经元突触生长明显受到抑制,突起变短。经Fasudil处理后的MS患者血清,可改善神经元活力和突触形成；而处理正常血清后,二者血清对神经元活力、突起长度作用无差异。MS血清组Synaptophysin表达降低。Fasudil可增加Synaptophysin的表达。结论：MS患者血清中升高的Rho激酶抑制培养神经元突触形成,Fasudil可以改善神经元突触形成,同时诱导Synaptophysin表达。第二部分Rho激酶在原代神经元突触损伤和形成中的作用及其机制研究目的：通过细针划痕和MS血清损伤神经元突触,了解Rho激酶及其抑制剂Fasudil在神经突触损伤和再生中的作用及其下游突触生长相关蛋白的表达情况。方法：培养原代小鼠皮层神经元,利用细针划痕损伤神经元。首先进行Rho激酶磷酸化底物p-MYPT1和p-MLC2免疫荧光染色观察划痕神经元Rho激酶活性变化。然后,利用Rho激酶抑制剂Fasudil观察其对划痕神经元CRMP-2和GSK3β-Tyr216磷酸化水平的作用。同时,MS患者和正常血清以及Fasudil处理的血清分别按1：10的比例加入至培养神经元,测定CRMP-2和GSK3β磷酸化水平的变化。结果：神经元划痕损伤后p-MYPT1和p-MLC2阳性细胞显著多于未划痕对照神经元。划痕后48h,划痕神经元CRMP-2磷酸化水平显著高于未划痕对照组；Fasudil干预后CRMP-2磷酸化水平则明显降低。GSK3β-Tyr216磷酸化水平在划痕后各组各个时间点无有意义的变化。MS血清处理神经元48小时后,CRMP-2磷酸化水平升高,但和正常血清组比较没有统计学差异。Fasudil处理后可降低MS血清组CRMP-2磷酸化水平,但仍高于正常血清+Fasudil组。血清处理后各组神经元GSK3β-Tyr216磷酸化水平没有差异。结论：体外实验提示,Rho/Rho激酶通路抑制神经元突触生长的机制：1)通过MLC磷酸酶/MLC途径促进肌动球蛋白收缩,2)可能通过磷酸化CRMP-2阻碍微管蛋白组装,引起生长锥塌陷。第三部分Rho激酶抑制剂法舒地尔在实验性自身免疫性脑脊髓炎中对神经元突触形成的作用及其机制研究目的：了解Rho激酶抑制剂法舒地尔(Fasudil)在实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, EAE)中的治疗潜能及其对神经元突触生长的作用和可能的分子机制。方法：雌性C57BL/6小鼠,随机分为CFA对照组、EAE组、Fasudil晚期治疗组和Fasudil早期治疗组。EAE模型采用MOG35-55多肽诱导的慢性模型。早期治疗组和晚期治疗组分别在免疫后第三天和疾病症状出现时开始腹腔注射Fasudil (40mg/kg/d),直至免疫后第28天,期间观察并比较各组小鼠临床症状和体重变化。免疫后第28天,取脑和脊髓进行HE染色和CD4+T细胞染色。同时提取组织蛋白,采用Western blot法检测脑和脊髓p-MYPT1、p-CRMP-2及p-GSK3β的表达。取EAE及Fasdudil治疗各组脑和脊髓蛋白提取液,加入至培养神经元中,观察神经元突触生长情况。结果：Fasudil治疗推迟临床发病时间,显著改善EAE症状,尤其是早期治疗。病理检查发现Fasudil减轻中枢神经系统炎性细胞浸润,包括CD4+T细胞。与CFA组相比,EAE小鼠脑和脊髓p-MYPT1表达增高,脑内表达比脊髓更高。在脑内,Fasudil晚期治疗可降低p-MYPT1的表达；早期治疗则更显著。在脊髓,Fasudi1早期治疗才显著降低p-MYPT1的表达；晚期治疗有降低的趋势,但没有统计学意义。取小鼠脑和脊髓蛋白提取液加入至培养神经元中,发现EAE组蛋白提取液抑制突触形成,而Fasudil早期和晚期治疗组蛋白提取液均可明显促进神经元突触形成,同时伴随CRMP-2磷酸化水平的降低。GSK3β-Tyr216磷酸化水平仅在脑内被Fasudil抑制。结论：EAE病程中存在Rho激酶激活,脑内更甚。Fasudil治疗尤其是早期治疗改善EAE症状。Fasudil降低脑和脊髓的Rho激酶活性,促进神经元突触形成。突触的抑制作用可能通过Rho激酶磷酸化CRMP-2影响微管蛋白组装所致。Fasudil通过抑制CRMP-2磷酸化改善神经突触生长。结论1.MS血清Rho激酶活性升高,并可抑制神经元突触的形成。抑制Rho激酶可促进神经元活力和突触生长。2.EAE病程中Rho激酶激活,Fasudil治疗抑制Rho激酶活性,改善EAE症状,并促进神经元突触的形成。3.神经突触的抑制作用可能通过Rho激酶磷酸化CRMP-2影响微管蛋白组装所致。Fasudil通过抑制CRMP-2磷酸化改善神经突触生长。