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面对整个世界能源供应紧缺和能源环境问题,环保高效的生物能源的发展是必然的。近年来,以微生物油脂为原料的生物柴油的生产由于生产成本较低、油脂成分与植物油相似而受到社会各界广泛关注。本课题选用油脂酵母皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum ACCC20271)为实验菌株,在合成培养基中对其发酵条件(碳氮比、溶氧、初始pH等)进行优化,获得了适合该菌株生长和产油的最优条件,为研究该菌株的油脂合成调控机理奠定了基础。同时,针对油脂积累过程中所需还原力(NADPH)的来源问题,本实验从酶活、转录和生化等不同水平来研究苹果酸酶(ME)催化的反应和磷酸戊糖(PP)途径所产生的NADPH对油脂积累的贡献程度,为进一步探索油脂微生物的油脂合成机理提供可靠的依据。1.对本实验中产油培养基进行优化后得出,最适合该菌株生长和产油的碳氮比为82.5(C-mol/N-mol);此时菌体量(11.7g/L)较原始条件提高了将近40%,产油量(3.76g/L)也较原始条件提高了30%以上,说明这些条件对菌体的高密度培养是很重要的。另外菌体的含油率可能受到其它因素(还原力等)的限制,有待通过其他手段来进一步探究影响菌体油脂积累能力的因素。此外,实验还表明该菌株合成油脂的成分含量与葵花籽、玉米油等油脂中脂肪酸含量相似,是很好的生物柴油原料生产菌。2.针对油脂酵母内产生NADPH的两个途径——ME催化的反应和PP途径,通过研究关键酶ME和G6PDH的活性变化与油脂积累程度的关联性来进一步揭示油脂积累的机理。实验表明,氮限条件下细胞培养至18h左右氮源耗尽,油脂合成机制启动。同时发现该条件下,在油脂快速积累时细胞内的苹果酸酶活性相对于菌体快速增长期增长了约2.5倍,；而在氮源充足条件下该酶的活性无明显变化,说明苹果酸酶催化的苹果酸氧化脱羧反应与油脂的大量合成紧密相关。研究同时发现在氮限条件下,油脂合成期的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性较菌体快速生长期也有一定程度的提高,但与氮源充足条件下该酶活性的变化相比并无明显提高,表明戊糖磷酸途径流量的变化与皮状丝孢酵母中油脂代谢没有明显的关联性。3.实验通过CODEHOP引物设计和简并PCR方法对皮状丝孢酵母体内的ME和G6PDH的编码基因me和zwf进行克隆,得到了这两个基因的部分序列信息。为后续油脂积累的分子水平的深入研究奠定基础。4. qRT-PCR实验结果显示,me在转录水平上并不受到氮源限制条件的调节,说明在油脂积累过程中ME活性的迅速升高是一系列复杂调控的结果,而不是单一基因的调节；zwf在转录水平上同样不受氮源限制条件的调控,并且在油脂积累期其相对转录量显著下降,说明了G6PDH主要是在菌体的快速生长过程中起到关键作用。