论文部分内容阅读
市面上雷公藤属制剂种类较多,不同制剂间成分差异明显,临床上将其混淆使用会引起较大的安全隐患,因此对雷公藤属制剂进行多指标质量控制尤为重要。火把花根片（colquhounia root tablet,CRT）是由雷公藤属植物昆明山海棠的去皮根芯制备而成,相比于同属其他制剂毒性更小,广泛应用于自身免疫性疾病和肾脏疾病的治疗。他克莫司（tacrolimus,TAC）是一种新型的免疫抑制剂,但其价格昂贵、治疗窗窄、药代动力学个体差异明显,需要进行严密的血药浓度监测。CRT与TAC均具有强大的抗炎和免疫抑制活性,两者联合应用于肾脏疾病治疗时具有协同增效的作用,但TAC与CRT之间是否存在药动学相互作用还未见报道。目的:（1）比较不同厂家雷公藤属制剂（雷公藤片、雷公藤多苷片、昆明山海棠片、CRT）中5种代表性成分的含量差异。（2）研究CRT对大鼠体内TAC药代动力学的影响及其分子机制。方法:（1）建立HPLC-MS/MS法测定雷公藤属制剂中5种代表性成分的含量雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷公藤晋碱、雷公藤次碱:ACE Ultra Core Super Phenyl Hexyl色谱柱,流动相:含5 m M碳酸氢铵的水溶液（A相）-甲醇（B相）,梯度洗脱。雷公藤红素:ACE Excel C18-AR色谱柱,流动相:含0.5%甲酸的水溶液（A相）-含0.1%甲酸的乙腈（B相）,等度洗脱。应用ESI+和MRM。将测定方法应用于9个厂家共14个批号雷公藤属制剂的含量测定。（2）药代动力学研究检测大鼠全血中TAC的HPLC-MS/MS方法,以子囊霉素为内标。ACE Excel CN-ES色谱柱,流动相为含0.1%甲酸和2 m M乙酸铵的水溶液（A相）-乙腈（B相）,梯度洗脱,应用ESI+和MRM。CRT单次给药对TAC药代动力学的影响:健康雄性SD大鼠36只,随机分为对照组和5个合用组,对照组以0.5%CMC-Na溶液灌胃;合用组分别以50,150,300,600,1200 mg·kg-1 CRT灌胃,间隔30 min后各组均给予TAC 1.2 mg·kg-1,24 h内连续采血,测定TAC的血药浓度。CRT多次给药对TAC药代动力学的影响:健康雄性SD大鼠12只,随机分为对照组和合用组。对照组连续15 d灌胃0.5%CMC-Na溶液,合用组连续15 d灌胃CRT300 mg·kg-1,两组末次给药30 min后均给予TAC 1.2 mg·kg-1,24 h内连续采血,测定TAC的血药浓度。（3）CRT影响TAC药代动力学的机制探究CRT预处理后,检测大鼠肝脏和小肠中CYP3A1、CYP3A2、P-gp、MRP2、CAR和PXR的表达水平;建立咪达唑仑体外孵育体系并联合分子对接手段,考察CRT及其活性成分对TAC生物转化过程中关键蛋白的影响。结果:（1）不同厂家雷公藤属制剂中5种成分含量差别较大,CRT中雷公藤甲素含量最高,其余品种制剂中雷公藤晋碱、雷公藤次碱和雷公藤红素含量较高。以5种成分的总含量计,昆明山海棠片中含量最高,其次为雷公藤片和雷公藤多苷片,CRT中含量最低。（2）检测大鼠全血中TAC的HPLC-MS/MS方法,线性范围为0.2~200 ng·m L-1。批内和批间精密度RSD（%）≤15%,低、中、高3个浓度质控样本的内标归一化基质效应因子分别为99.92%,100.35%,102.52%;提取回收率分别为87.15%,96.26%,98.47%。（3）与对照组相比,CRT 5个剂量组（50,150,300,600,1200 mg·kg-1）中TAC的Cmax分别提高了71.70%,226.85,254.42%,148.42%,168.29%;AUC（0-∞）分别提高了10.31%,91.09%,195.30%,156.76%,125.66%。CRT对TAC药代动力学的影响存在剂量相关性,Cmax和AUC（0-∞）随CRT剂量递增而逐渐增加,当剂量达到300 mg·kg-1时,Cmax和AUC（0-∞）均达到最大值,随后呈现递减的趋势。（4）与对照组相比,经CRT（300 mg·kg-1）连续15 d预处理后,大鼠体内TAC的Cmax和AUC（0-∞）分别提高了102.78%和71.01%。但与单次CRT给药相比,多次CRT给药后TAC主要药代动力学参数的变化幅度有所减小,表明单次给药对TAC的药代动力学有更大的影响。（5）RT-q PCR和Western blot结果表明在肝脏和小肠中,CRT能够显著提高核受体CAR和PXR的表达水平,而显著降低药物代谢酶CYP3A1和CYP3A2以及药物转运体P-gp和MRP2的表达水平。（6）大鼠肝微粒体体外初筛结果发现,表儿茶素和雷公藤内酯甲对CYP3A2酶活性的抑制作用不明显,其余成分对CYP3A2酶活性的抑制作用较强,抑制能力:雷公藤红素（IC50=8.33μM）＞雷公藤晋碱（IC50=22.18μM）＞雷公藤次碱（IC50=22.22μM）＞雷公藤内酯酮（IC50=75.19μM）＞雷公藤甲素（IC50=100.34μM）。其中,雷公藤晋碱和雷公藤次碱对CYP3A2酶的抑制作用为竞争性抑制,Ki值分别为19.00μM和27.33μM,雷公藤红素对CYP3A2酶的抑制类型为混合型,Ki值和αKi值分别为1.18μM和3.04μM。（7）分子对接结果表明,雷公藤甲素、雷公藤内酯酮、雷公藤晋碱、雷公藤次碱和雷公藤红素均能与CYP3A4或P-gp自发结合,氢键、疏水作用力和范德华力是主要的结合相互作用力。Hem508、Ile369、Arg105、Glu374和Phe213是上述5种成分与CYP3A4结合的关键作用位点,Ile336、Val978、Phe332、Phe728、Phe974和Tyr303是上述5种成分与P-gp结合的关键作用位点。结论:本研究建立了HPLC-MS/MS法测定雷公藤属制剂中5种有效成分的含量,有利于实现雷公藤属制剂的多指标质量控制。药代动力学实验结果表明CRT能够显著提高TAC的血药浓度,并且长期服用CRT会对CYP3A1、CYP3A2、P-gp和MRP2的表达产生抑制作用,对CAR和PXR的表达产生诱导作用。体外肝微粒体孵育实验和分子对接进一步证明CRT是通过抑制CYP3A和P-gp的活性抑制TAC的代谢和转运。