研究背景根据2020年全球癌症统计分析,肺癌位居世界新发癌症的第二位（占总病例的11.4%）,但却是癌症相关死亡的最主要原因（占比18%）。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）在所有肺癌病例中所占比例约为80%,主要包括鳞状细胞癌和腺癌两大类型。尽管目前的诊断方法和治疗手段取得了较大的进展,但NSCLC患者的5年总生存率仍然很低,仅为10-20%。其预后不良的主要原因是大多数患者在确诊时已处于局部晚期或出现了远处转移,错失了最佳治疗时机。因此,NSCLC的早期诊断与转移预警是肺癌研究领域的主要挑战之一,更重要的是,探究NSCLC转移及其潜在的分子机制,对于寻找抑制NSCLC转移的治疗靶点,提高患者的生存率具有长远意义。近年来,细胞外载体因其在生理和病理上的众多功能而重新引起人们的兴趣。外泌体是一类细胞外囊泡,具有脂质双分子层结构,大小约为30mm-100nm。它们起源于内体系统,由溶酶体微粒内陷形成,并且泡内携带DNA、mRNA、非编码RNA、蛋白质和脂质等物质。细胞可利用外泌体作为媒介,将携带的生物分子传递到邻近或远处的细胞并影响其功能。所有的细胞类型,包括肿瘤细胞,都能够在特定的生理或病理条件下产生外泌体。值得注意的是,包裹在外泌体中的RNA分子（如miRNAs）与游离形式相比,对RNAse A酶的抵抗力更强,能直接反映来源细胞的生理病理状态,因此可以作为新型的生物标志物。此外,肿瘤来源的外泌体已经被确定为调节肿瘤微环境的媒介,在协调肿瘤形成与进展,促进血管生成、侵袭和转移以及免疫逃逸等方面起到重要作用。越来越多的研究表明:肿瘤产生的外泌体参与了肿瘤的转移过程,最主要表现在以下几方面:（1）肿瘤产生的外泌体可赋予受体细胞间充质特性,使其发生上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）,这一过程通过提高细胞的迁移活性,从而激活转移发生的起始阶段;（2）肿瘤产生的外泌体能将间充质干细胞转化变为癌症相关成纤维细胞,后者与癌细胞交叉融合后,改变肿瘤微环境,在减少正常上皮细胞产生的同时进一步诱导EMT;（3）肿瘤细胞来源的外泌体通过刺激被肿瘤细胞种植的内皮祖细胞,进一步形成管状结构,从而诱导新生血管的形成,为转移灶提供氧气,也提供血源性播散的入口;（4）肿瘤细胞产生的外泌体对器官特异性转移起着决定性作用,也就是说,只有当种子和土壤相容时,即肿瘤细胞与宿主器官匹配时,肿瘤细胞的转移才会发生。MiRNA是一类长度为19-22个核苷酸的内源性小型非编码RNA。在某些情况下,miRNA可以靶向信使RNA（mRNA）的特定区域,例如3’非翻译区（3’UTR）,从而导致mRNA的降解或抑制蛋白质的翻译。可见,miRNA通过靶向mRNA进而在各种生物学过程中发挥关键功能。此外,由于miRNA通常位于染色体的“易碎区域”,这些区域的缺失、重排和扩增频率很高,并且与恶性肿瘤有关,包括肿瘤的发生和发展、细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡。因此miRNA在肿瘤研究领域受到了学者们的关注。血清中外泌体是由细胞分泌入血的,能真实反映来源细胞状态,而外泌体中的miRNAs因具有调节基因表达的能力,且在细胞外环境中稳定存在,因此它们被广泛用作癌症和其他疾病的无创诊断性或预后判断的生物标志物。外泌体miRNAs也被发现是调节肿瘤增殖、血管生成、转移、免疫调节和抑制耐药的信号分子,参与了肿瘤进展的多个环节,更重要的是在肿瘤转移过程中扮演重要角色。此外,已有学者对高转移性肝癌细胞株、高转移性乳腺癌细胞株如何通过传递外泌体miRNAs教育低转移细胞株,并调控受体细胞的生物学功能等方面进行了研究,但在肺癌研究领域中,这部分的内容尚为空白。因此,基于以上研究背景和理论基础,我们设计并进行了本次研究,目的就是寻找能够应用于NSCLC早期诊断及预警转移的血清外泌体miRNAs生物标志物,并进一步研究外泌体miRNAs参与其侵袭转移的分子机制,主要包括以下两部分内容:第一部分血清外泌体miRNAs作为非小细胞肺癌生物标志物的研究研究目的筛选非小细胞肺癌（NSCLC）患者血清外泌体中差异表达的miRNAs,评价其作为NSCLC早期诊断以及转移预警生物标志物的诊断效能。研究方法1.利用低温超速离心法获得健康志愿者（Healthy donors,HD）和NSCLC患者的血清外泌体,使用qNano,透射电镜以及western blot三种方法分别对外泌体的大小、形态和表面标志性蛋白（TSG101和CD9）进行检测。2.MiRNAs芯片技术筛选健康志愿者和NSCLC患者间、非转移性与转移性NSCLC患者间差异表达的外泌体miRNAs（ExmiRNAs）。3.提取大样本队列研究中的血清外泌体总RNAs,采用实时荧光定量PCR方法（RT-PCR）对差异表达的miRNAs进行定量分析,筛选出应用于NSCLC早期诊断以及转移预警的生物标志物,同时结合临床常用的肿瘤标志物（CEA、CYFRA21-1）制作ROC曲线以评估其诊断效能。4.查阅并记录NSCLC患者住院病例信息和临床病理参数,如年龄、性别、吸烟史、饮酒史、淋巴结转移、远处转移以及TNM分期等。根据AJCC临床肿瘤分期标准对NSCLC进行分期。分析目标miRNAs的表达水平与NSCLC患者常见临床病理特征之间的相关性。5.分别提取血清外泌体（EXO）和去外泌体上清液（EDS）中的RNAs,检测miRNAs的存在位置;外泌体使用RNAse A酶处理或在室温下放置不同时间后,提取RNAs并检测目标miRNAs的含量变化,检验外泌体内miRNAs的稳定性。6.对接受一线化疗的病人进行随访,根据患者治疗情况与外泌体miRNAs的表达水平,评估其在预测NSCLC化疗疗效中的作用。研究结果1.qNano及电镜分析分析结果显示,外泌体呈现为直径分布在60 mm到160 mm之间的圆形囊泡;western blot可检测到外泌体的表面标记蛋白TSG101和CD9。2.早期诊断标志物的筛选:根据Fold change≥2为判断标准,选取miRNAs芯片技术筛选出的健康志愿者和NSCLC患者间28种差异表达的miRNAs（9个在NSCLC患者中表达上调,19个下调）作为研究对象,通过检测这些目标miRNAs在282名健康志愿者与276名NSCLC患者血清外泌体中的表达量发现,外泌体miR-20b-5p和miR-3187-5p的在NSCLC患者中的表达水平显著下调（p＜0.0001）。通过受试者工作特征曲线（Rece-iver operating characteristic,ROC 曲线）评估这两种外泌体 miRNAs（ExmiRNAs）的诊断能力,结果显示,对于ExmiR-20b-5p和ExmiR-3187-5p,AUC（Area under the curve,ROC曲线下面积）分别为0.818（95%CI:0.784-0.853）和0.690（95%CI:0.646-0.733）。联合ExmiR-20b-5p和ExmiR-3187-5p可以将AUC提高到0.848（95%CI:0.817-0.880）。CEA与ExmiR-20b-5p和ExmiR-3187-5p联合诊断NSCLC的AUC增加到0.905（95%CI:0.880-0.929）。同样,CYFRA21-1 与ExmiR-20b-5p、ExmiR-3187-5p联合应用也将NSCLC的诊断能力提高到0.894（95%CI:0.868-0.920）。此外,与健康对照组相比,ExmiR-20b-5p和ExmiR-3187-5p的表达水平与早期NSCLC（0和Ⅰ期,n=104）具有显著相关性（p＜0.0001）。ExmiR-20b-5p和ExmiR-3187-5p的AUC分别为0.810（95%CI:0.764-0.865）和0.673（95%CI:0.617-0.728）。两者联合后,AUC提高到0.838（95%CI:0.794-0.881）。使用CEA、CYFRA21-1 分别与ExmiR-20b-5p及ExmiR-3187-5p联合,结果显示AUC分别增加至0.930（95%CI:0.900-0.959）与0.928（95%CI:0.896-0.959）。通过与临床特征资料进行分析后发现,两种早期诊断标志物与患者的年龄、性别、病理类型等因素均无相关性。3.转移预警标志物的筛选:同样,根据Fold change≥2为判断标准,选取miRNAs芯片技术筛选出的30种非转移性与转移性NSCLC患者间差异表达的外泌体miRNAs（15个在转移性NSCLC患者中表达上调,15个下调）作为分析对象,通过检测这些目标miRNAs在173名非转移性与132名转移性NSCLC患者血清外泌体中的表达量发现,外泌体miR-212-5p和miR-651-3p在转移性NSCLC患者中的表达水平显著下调（p＜0.0001）。通过ROC曲线评估这两种ExmiRNAs的诊断能力,结果显示,对于ExmiR-212-5p和ExmiR-651-3p,AUC分别为0.746（95%CI:0.691-0.802）和 0.688（95%CI:0.628-0.749）。联合ExmiR-212-5p和ExmiR-651-3p可以将AUC提高到0.751（95%CI:0.697-0.806）。CEA与ExmiR-212-5p和ExmiR-651-3p联合诊断NSCLC的AUC增加到0.787（95%CI:0.736-0.838）。经统计分析发现,ExmiR-212-5p和ExmiR-651-3p的表达水平与肿瘤分期密切相关。而在临床特征关系分析中,它们与年龄、性别、吸烟等因素也无相关性,但与淋巴结转移和远处转移密切相关。4.与无外泌体上清相比,miRNAs在外泌体中表达量显著增高;并且使用RNAse A酶处理外泌体或将外泌体在室温下放置不同时间后,其包含的miRNAs的表达水平无明显变化。5.随访64名接受一线化疗的病人,发现ExmiR-212-5p的高表达水平与患者较好的化疗疗效具有相关性（P=0.024）。研究结论1.血清外泌体miR-20b-5p和miR-3187-5p可以作为NSCLC早期诊断的生物标志物,血清外泌体miR-212-5p和miR-651-3p可以作为预警NSCLC转移的生物标志物,联合CEA或CYFRA21-1能提高诊断效能;2.血清外泌体miR-212-5p可以作为潜在的预测化疗疗效标志物。第二部分外泌体miRNA-632参与非小细胞肺癌转移的机制研究研究目的1.研究目标miRNA-632对NSCLC细胞增殖、迁移侵袭、上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）等生物学行为的影响,以及对人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC）血管成管能力的调控。2.验证外泌体能够携带miRNA-632由高转移性NSCLC细胞株转移至低转移性NSCLC细胞株及人脐静脉内皮细胞,进而影响受体细胞的生物学行为,进一步证实目标miRNA-632分子的调控功能。3.寻找miRNA-632的目标靶基因并进行验证,探究外泌体miRNA-632促进NSCLC增殖转移的分子机制。研究方法1.选取前期芯片技术检测出的非转移性与转移性NSCLC患者间血清外泌体中32个差异表达的候选miRNAs分子（均在转移患者中表达水平显著上调）,通过qRT-PCR同时在NSCLC细胞株（高转移细胞株95-D、低转移细胞株A549和SPCA-1）检测其相对表达量,筛选出表达差异最大的目标miRNA,随后在非转移性与转移性NSCLC患者的血清外泌体中检测目标miRNA的表达水平。2.分别在低转移性NSCLC细胞株A549、SPCA-1及HUVEC中过表达目标miRNA,应用CCK8实验、克隆形成实验、Transwell、划痕实验以及western blot实验研究其对细胞的增殖、克隆形成能力、迁移侵袭能力,以及对上皮间充质转化能力的影响;血管成管实验中检测对血管成管能力的调控。3.荧光染料PHK67及DAPI分别标记95-D细胞株外泌体与A549细胞株的细胞核,两者共孵育后,观察评估受体细胞对外泌体的摄取。4.提取高转移性NSCLC细胞株95-D的外泌体,用外泌体分别处理低转移性NSCLC细胞A549、SPCA-1细胞和人脐静脉内皮细胞。继续使用增殖、克隆形成、迁移侵袭实验、EMT试验及血管成管实验来研究外泌体孵育后,受体细胞生物学行为的改变。5.构建裸鼠皮下肿瘤种植模型后,分别在对照组与实验组的瘤体内多方向同时注射PBS,95-D外泌体,95-D外泌体+inhibitormiRNA,验证体内实验中,外泌体miRNA对肿瘤细胞增殖能力的影响。6.利用生物信息学分析和双荧光素酶报告基因测定法寻找目标miRNA的靶基因,通过合成含靶基因的质粒,并转染至细胞中后观察其对NSCLC细胞、HUVEC功能的影响,并进一步证实其作为目标miRNA下游靶基因的准确性。研究结果1.通过qRT-PCR我们发现,与低转移性NSCLC细胞株A549、SPCA-1相比,miRNA-632在高转移性NSCLC细胞株95-D中高表达,并且在95-D的外泌体中的表达量也显著增高;进一步分析发现,miRNA-632在转移性NSCLC患者（n=83）的血清外泌体样本中表达量显著高于非转移性NSCLC患者（n=199）,差异具有统计学意义（P=0.0006）。2.转染miRNA-632模拟物后能提高A549、SPCA-1细胞的增殖、克隆形成、迁移侵袭能力,能促进肿瘤细胞的上皮间质转化,并且能提高HUVEC的新生血管成管能力。3.荧光显微镜观察到95-D细胞外泌体能被受体细胞（A549细胞）内化。4.高转移性NSCLC细胞株95-D的外泌体能够携带miRNA-632转移至低转移性NSCLC细胞株A549、SPCA-1与人脐静脉内皮细胞,不仅可以提高受体细胞的增殖、克隆形成、迁移侵袭能力,促进EMT,并且能够促进血管成管;当抑制外泌体中miRNA-632的表达量时,外泌体呈现出对受体细胞的正向促进作用也受到抑制,即迁移侵袭能力、EMT、血管成管能力降低。5.动物实验中,外泌体miRNA-632能促进裸鼠体内肿瘤的生长,而抑制miRNA-632后,肿瘤体积减小。6.双荧光素酶报告实验结果表明了 miRNA-632可直接特异性结合Sec23A的3’UTR并在转录后水平影响基因的表达。与对照组相比,过表达Sec23A能抑制NSCLC细胞的克隆形成、侵袭迁移能力、EMT以及抑制内皮细胞的血管成管能力。研究结论1.高转移性NSCLC细胞株95-D来源的外泌体能进入低转移性NSCLC细胞株,促进增殖、克隆形成、迁移侵袭能力及上皮间充质转化,能进入人脐静脉内皮细胞促进血管成管能力,以上作用是通过miRNA-632下调Sec23A的表达来实现的。2.外泌体miRNA-632是预测NSCLC转移的潜在生物标志物。