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背景骨质疏松症（Osteoporosis,OP）是一种全身性的代谢性骨骼疾病,OP患者骨骼微结构受损,导致骨密度（Bone Mineral Density,BMD）下降,从而增加骨骼脆性,增加骨折的风险。体内成骨细胞（Osteoblast）和破骨细胞（Osteoclast）的微平衡对BMD影响重大,因此,骨质疏松症的治疗主要包括抑制骨吸收或刺激骨生成。破骨细胞是源自骨髓祖细胞的单核巨噬细胞谱系的大型多核细胞,并且是体内唯一能够吸收骨质的细胞。破骨细胞对骨重塑至关重要,骨重塑是控制骨质生长、骨骼维持和骨折修复的基本过程,在骨质疏松症发病机制中起着核心作用。核因子κB受体活化因子配体（Receptor Activator of Nuclear FactorκB ligand,RANKL）（TNFSF11）作为一种由成骨细胞谱系表达的蛋白。破骨细胞的分化需要相关分子信号的激活,信号通路激活的源头便是由于RANKL结合到破骨细胞前体细胞的受体RANK（TNFSRF11A）,从而启动破骨细胞分化所必需的信号传导。异补骨脂素（Angelicin/Isopsoralen）是中药补骨脂中分离得到的主要生物活性化合物,属于香豆素类化合物。异补骨脂素被广泛用于治疗各种疾病,包括湿疹、银屑病、糖尿病、癌症和骨质疏松症。既往研究表明异补骨脂素能够促进骨及软骨形成,且有报道称,异补骨脂素可刺激骨髓间充质干细胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs）向成骨细胞分化,并抑制向脂肪细胞的分化。此外异补骨脂素能抑制过氧化氢（H2O2）诱导的成骨细胞凋亡。在体内研究中,异补骨脂素还能改善雌性和雄性小鼠因性激素缺乏引起的骨质疏松症。然而,异补骨脂素对破骨细胞的作用及抗骨质疏松的机制尚未被完全了解。通过生物信息学技术能够识别患者与正常人的差异表达的基因,还可以根据蛋白相互作用和基因富集分析预测关键基因及其相关的分子机制。因此生物信息学分析已被广泛应用于疾病机制的识别和靶基因的寻找。目的本研究利用生物信息学分析来确定异补骨脂素的靶基因和参与破骨细胞分化过程中差异表达基因的信号通路,采用基因富集分析方法,寻找异补骨脂素靶基因与参与破骨细胞分化过程中差异表达基因共有的KEGG通路,从而获得核心基因。经合理推断后,预测异补骨脂素通过抑制NF-κB信号通路来阻碍破骨细胞分化,并通过一系列基础实验来验证猜想。方法我们将不同浓度的异补骨脂素与相同浓度RANKL一起加入培养小鼠原代单核巨噬细胞的培养基中,在5天后对诱导的破骨细胞进行抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色,并从蛋白及RNA层面检测异补骨脂素对破骨细胞分化的生物学功能。随后利用STITCH在线数据库默认的搜索方法,找到出异补骨脂素可能作用的靶基因及化合物。利用Cytoscape 3.8.2软件建立靶基因的互作网络,并利用RStudio软件分析得到异补骨脂素靶基因的京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路。为了找到破骨细胞分化过程中起作用的相关基因,我们利用GEO（Gene Expression Omnibus）在线数据储存库的找到了GSE176265数据集,通过RStudio软件找到了用RANKL诱导的原代小鼠骨髓来源的单核巨噬细胞3天前后有差异表达基因（Differentially Expressed Genes,DEGs）,并对其进行了KEGG分析。随后对异补骨脂素的靶基因与破骨细胞分化过程差异表达基因共有的KEGG通路进行富集分析预测异补骨脂素抑制破骨细胞分化的信号通路机制。最后通过基础实验来验证我们生信分析的结果。结果通过不同浓度的异补骨脂素对原代小鼠单核巨噬细胞的细胞活力检测实验（MTT）,我们发现在异补骨脂素浓度＜50μM的情况下不影响细胞的活力与增殖。随后我们用不同浓度的异补骨脂素（0μM、10μM、20μM、30μM）处理细胞5天后,通过TRAP染色发现随着浓度的增加逐渐抑制了破骨细胞的分化,且破骨细胞分化过程中典型的标志蛋白（NFATc1、MMP9、CTSK）表达逐渐降低,并且通过q-PCR在RNA层面也验证了蛋白表达的结果。接着我们利用利用STITCH数据库默认的搜索方法,总共找到30个异补骨脂素可能作用的蛋白及化合物,其中28个为异补骨脂素的靶基因,利用Cytoscape 3.8.2软件建立互作网络。我们使用RStudio软件分析得到异补骨脂素靶基因富集的KEGG通路,P＜0.05的一共有87条。然后利用GSE176265数据集,取RANKL诱导分化原代小鼠单核巨噬细胞0天和3天的RNA-seq数据进行差异表达基因分析,当以|Log FC|＞2且P＜0.05为筛选标准时,一共分析得到174个DEGs,其中有111个表达下降,63个表达上升,紧接着对DEGs做KEGG分析后,一共有41条P＜0.05的通路。将异补骨脂素靶基因富集的KEGG通路与RANKL诱导分化原代小鼠单核巨噬细胞0天和3天的DEGs富集的KEGG通路取交集,然后取P值最小的前5条KEGG通路使用R语言包（GoPlot）进行富集分析,预测异补骨脂素可能通过抑制NF-κB信号通路的激活,起到抑制RANKL诱导的破骨细胞分化的作用。最后使用30μM的异补骨脂素处理细胞1小时来验证我们生信分析的预测。本次研究的结果提示异补骨脂素能抑制RANKL诱导的破骨细胞分化,且是通过抑制NF-κB信号通路来实现的。结论1.异补骨脂素能抑制RANKL诱导的破骨细胞分化;2.异补骨脂素通过抑制NF-κB信号通路抑制RANKL诱导的破骨细胞分化;