研究背景:人的一生目前只有两个牙列,即乳牙列与恒牙列,在12-13岁恒牙列完全萌出之后,人类本身的牙齿就随着使用的时间产生不可避免的磨耗。人类口齿的健康健全是消化系统发挥功能,为身体输送营养的开端,但随着人类寿命的延长、食物的多样化发展,各种各样的先天性和后天性因素使得不少患者的牙齿逐渐失去原有功能。而一旦恒牙缺失,我们没有办法进行完整的牙齿再生,缺牙对于患者来说既是健康上的威胁,又是心理上的障碍。目前有学者把种植义齿形容为人类的“第三副牙齿”,诚然,与传统可摘活动义齿或固定桥修复体相比,种植义齿是目前对正常牙伤害最小的修复手段,但其不可回避的具有一系列诸如对骨量及个体身体健康要求高、费用昂贵、修复周期长等劣势。随着人们对于牙齿保健意识的提高,一副真正属于个体的“第三副牙齿”成为了牙医界亟待解决的难题和焦点。牙齿的发育与再生成为了极具研究价值的热点科学。近年来,牙齿发育与再生的模式动物多选择小鼠、小香猪、狗等哺乳动物,大量研究也带来了我们对于牙齿的发生发育、迁移分化、组织间相互作用及牙齿硬组织的沉积形成与萌出、牙根的生长都有了不同程度的认知。然而,哺乳动物具有一定的局限性,由于哺乳动物的胚胎发育在母体内进行,局部组织深埋于皮下或结缔组织下,实验与观察都有一定的不便,实验条件较为苛刻繁琐,使得受精后数小时内的最早期胚胎发育过程中所牵涉到的分子调控机制的探索遇到了一些壁垒。斑马鱼是一种新型卵生的模式动物,具备一系列研究牙齿发育的优势,因此本实验选择斑马鱼作为模式动物。视黄酸对脊椎动物整个生长发育过程都起着非常重要的调控作用,在牙齿的发育初萌上也起着举足轻重的作用。本实验视黄酸促进模型主要是利用外源性视黄酸对各类鱼系进行培养,视黄酸抑制模型利用raldh2合成酶抑制剂DEAB进行外源性培养以抑制RA的合成,同时利用热激蛋白过表达转录RA降解酶cyp26a1促进视黄酸的分解,从而的到视黄酸缺乏或缺少的模型。在处理后的模型上进行整胚原位杂交,检测牙齿特异性蛋白的表达量。同时利用牙齿特异性荧光鱼系观察荧光表达的情况。目的:构建Hsp-cyp26a1-GFP;cryaa-Venus重组质粒,筛选RA降解酶cyp26a1编码序列过表达转基因鱼系。探究加入外源性RA和阻断体内RA合成以及加速体内RA降解对斑马鱼牙齿发育的影响。方法:本实验首先构建Hsp-cyp26a1-GFP;cryaa-Venus重组质粒,从斑马鱼的c DNA文库中克隆出cyp26a1的编码序列,连接进入热激蛋白质粒中。运用显微注射技术向单细胞期的斑马鱼胚胎动物极内注射重组质粒,重组质粒将随机整合到斑马鱼基因组内,经数代繁育筛选获得能够稳定遗传的Hsp-cyp26a1-GFP;cryaa-Venus转基因斑马鱼系。同时克隆四个神经嵴的特异性标记物的编码序列:dlx2a,dlx2b,scpp5,barx1。TA克隆后得到PGEMT载体上的基因序列。测序得到片段插入方向,根据插入方向选择sp6或t7 RNA聚合酶,进行RNA合成转录。利用不同浓度RA及DEAB处理转基因鱼系Tg:dlx2b-GFP和AB Go野生型斑马鱼。热激活cyp26a1后检测体内各牙齿特异性蛋白质表达水平高低。结果:本实验成功克隆了cyp26a1的转录本序列,经显微注射成功筛选出热激蛋白过表达cyp26a1的鱼系Tg:Hsp-cyp26a1-GFP;cryaa-Venus。同时获得了4个基因的反义m RNA核酸探针。与未处理的二甲基亚砜对照组相较而言,经过1×10-7?M视黄酸信号处理的barx1组、dlx2a在咽弓神经嵴的表达明显增强,并有由咽弓神经嵴向后段咽弓牙齿萌出位点迁移的趋势,绿色荧光向周边咽弓扩散;4×10-7?M RA处理组胚胎致畸率和死亡率极高,3×10-7?M RA处理组1/3胚胎发育迟缓。DEAB处理组神经嵴发育不良,barx1、dlx2a表达降低,dlx2b在牙齿位点的表达有所延迟。Cyp26a1经过热激活后能够成为很好的内源性加速RA降解的模型。实验结果类似利用DEAB阻断RA合成的结果,barx1的表达明显降低,dlx2a表达发生滞后效应,dlx2b和scpp5的表达有所延迟。结论RA能够通过调控咽弓神经嵴发育过程,进而调控牙齿发育前体细胞,最终达到调控牙齿发育的过程。