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研究目的乳腺癌是恶性肿瘤之一,严重威胁着女性的生命健康,如何有效地治疗乳腺癌一直备受关注。放射治疗即通过电离辐射(ionizing radiation,IR)治疗,是乳腺癌患者临床治疗常用手段,寻找有效的放射增敏剂是该领域的焦点问题。IR能导致严重的DNA损伤,即诱发DNA发生双链断裂(double strand breaks,DSBs)损伤,在DNADSBs损伤的修复机制中,同源重组(homologous recombination,HR)修复发挥了重要的作用。丙戊酸(valproic acid,VPA)是一种短链脂肪酸,具有抗肿瘤活性,我们课题组和其他研究小组均发现,0.5 mM VPA通过干扰BRCA1-RAD51介导的HR修复机制抑制肿瘤细胞生长并发挥放射增敏作用。野生型抑癌基因p53(wild-type p53,wtp53)具有抑制HR修复能力过度增强的作用,以维持HR功能处于正常的水平。有研究表明,在结直肠癌细胞中,p53通过干扰细胞凋亡机制影响VPA的放射增敏作用,表现为在wtp53细胞中VPA的放射增敏作用显著,而对于p53缺欠(defective p53,dp53)的细胞,其放射增敏作用受到抑制。本课题旨在拟探讨p53表达状态是否影响VPA对乳腺癌细胞的放射增敏作用及其作用机制与HR修复功能之间的关系,为VPA用于临床治疗乳腺癌患者提供可靠的理论指导及实验依据。研究方法1.p53表达下调同源配对细胞系工作模型的建立及p53蛋白表达的检测用含有PLKO.1和p53shRNA表达的慢病毒颗粒液感染乳腺癌细胞MCF7,建立稳定表达wtp53和dp53的同源配对细胞系;以MCF7细胞作为阳性对照,应用蛋白免疫印迹实验检测p53蛋白表达情况,以鉴定p53表达下调同源配对细胞系(wtp53和dp53)的建立情况。同时,将wtp53和dp53细胞分别分为对照组、VPA组(单独0.5 mMVPA作用24 h)、IR组(单独8GyIR)以及VPA+IR组(VPA预处理24 h后再联合8GyIR),应用蛋白免疫印迹实验再次检测各组p53蛋白的表达情况,再次确定在不同处理条件下wtp53和dp53细胞中p53的表达情况。2.细胞核DNADSBs的检测选取处于对数生长阶段的wtp53和dp53细胞,分别分为四组:对照组、VPA组(单独0.5mM VPA作用24 h)、IR组(单独8Gy IR)以及VPA+IR组(VPA预处理24h后再联合8GyIR)。准备两部分:一部分IR处理结束后恢复30min,收集各组单细胞悬液,进行中性彗星实验;另一部分IR处理结束后恢复6h后收集细胞制备单细胞悬液,进行免疫荧光实验。分别检测各组细胞核拖尾尾距及细胞核γH2AX焦点形成情况,分析细胞核内DNADSBs损伤程度。3.细胞存活能力的检测选取处于对数生长阶段的wtp53和dp53细胞,分别分为八组:对照组、VPA组(单独0.5mM VPA作用24h)、IR组(三组:单独2、4、6Gy)、VPA+IR(三组:0.5mM VPA预处理24h后分别联合2、4、6Gy IR)组。处理结束后,更换新鲜培养基,静置培养14天,终止培养,结晶紫染色后计算各组细胞的克隆形成百分率,以反映细胞的增殖存活能力。4.HR效率的检测将带有绿色荧光蛋白标记的HR底物报告基因pDR-GFP转入乳腺癌细胞MCF7,筛选出稳定表达pDR-GFP的MCF7细胞。用含有PLKO.1或p53shRNA表达的慢病毒颗粒液感染稳定表达的MCF7/pDR-GFP细胞,建立MCF7/pDR-GFP/wtp53和MCF7/pDR-GFP/dp53细胞,转染核酸内切酶I-sceI4h后,将细胞按照总数2-3*105接种于p60培养皿中,wtp53和dp53细胞各分为两组:对照组、VPA(单独0.5 mM VPA作用24h),药物处理结束后更换新鲜的细胞培养液,培养72h后胰酶消化,1000r/min离心5min,弃上清,PBS重悬,用流式细胞仪检测1*105个细胞,统计发出绿色荧光的细胞数,同源重组(HR)修复效率=绿色荧光细胞数目/(1*105),对比各组HR修复效率。5.HR修复关键蛋白BRCA1和RAD51表达的检测选取处于对数生长阶段的wtp53和dp53细胞,分为对照组、VPA组(0.5mM VPA作用24h)、IR组(单独8GyIR)、VPA+IR(0.5mM VPA 预处理24h,再给予8Gy IR),处理后固定细胞,应用免疫荧光技术检测BRCA1和RAD51在细胞核中的焦点形成情况,计数其焦点形成阳性细胞数占总细胞数的百分率。研究结果1.p53表达下调同源配对(wtp53和dp53)细胞系模型的建立根据蛋白免疫印迹实验结果,与MCF7细胞相比,感染慢病毒颗粒PLKO.1的细胞中p53蛋白表达未发生变化,感染慢病毒颗粒p53shRNA的细胞中p53表达明显下降,且VPA或IR处理后均未见p53表达,提示成功建立p53表达下调的同源配对细胞系(wtp53和dp53)。2.p53表达缺欠抑制VPA对IR所诱导细胞的DNA DSBs损伤蓄积作用根据彗星实验结果,wtp53表达的细胞中,与IR组相比,VPA+IR组细胞核拖尾尾距增加1.82倍(P<0.05),说明VPA可进一步增加IR诱导的细胞DNA DSBs损伤;在dp53表达的细胞中,与IR组相比,VPA+IR组细胞核拖尾尾距虽增加了 1.23倍,但仍显著低于wtp53细胞VPA+IR组(P<0.05),说明p53表达缺欠减弱VPA对IR诱导的细胞DSBs损伤的蓄积作用。根据免疫荧光实验结果,wtp53表达的细胞中,与IR组相比,VPA+IR组含γH2AX焦点阳性细胞百分率显著升高30.5%(P<0.05);在dp53表达的细胞中,与其IR组相比,VPA+IR组含γH2AX焦点细胞百分率虽略为增加,但与wtp53细胞中VPA+IR组相比仍显著降低30%(P<0.05),也说明抑制p53的表达后,VPA对IR诱导的乳腺癌细胞中DNA DSBs损伤的蓄积作用受到抑制。3.p53不同表达状态下,VPA与IR联合对乳腺癌细胞增殖存活能力的影响根据细胞克隆形成实验结果,未经IR处理时,在wtp53表达的细胞中,与对照组相比,VPA组克隆形成百分率降低23%(P<0.05),在dp53表达的细胞中,dp53细胞对照组细胞的克隆形成率与对照组相比增加50.3%(P<0.05),在此基础上进一步给予VPA处理,dp53表达的细胞VPA组细胞克隆形成率与对照组相比虽降低13.6%(P<0.05),但与wtp53细胞VPA组相比仍显著增加59.7%(P<0.05)。经IR处理后,以未经IR处理的相应各组为100%进行校正,各组细胞存活率随着IR剂量的增加显著降低。在wtp53表达的细胞中,与IR(2Gy)组相比,VPA+IR(2Gy)组克隆形成率降低了 8.4%(P<0.05);与IR(4Gy)组相比,VPA+IR(4Gy)组细胞克隆形成率降低了20.4%(P<0.05)。单独IR处理后,dp53表达的细胞IR(2、4、6Gy)组克隆形成率显著高于wtp53表达的细胞IR组(P<0.05);在此基础上,VPA与IR联合处理dp53表达的细胞,与IR组相比,VPA+IR组细胞存活率略为降低,但仍高于wtp53表达的细胞VPA+IR组(P<0.05),以上结果提示,VPA能增加wtp53表达的细胞的放射敏感性,但p53表达缺欠减弱VPA的放射增敏作用。4.VPA对乳腺癌细胞的HR修复能力的影响依赖于p53根据流式细胞实验结果,以MCF7/pDR-GFP/wtp53细胞对照组为100%进行校正,与对照组相比,给予VPA处理后,HR效率降低51.6%(P<0.05),表明在wtp53表达时,VPA可抑制细胞HR效率。在MCF7/pDR-GFP/dp53 细胞中,与MCF7/pDR-GFP/wtp53细胞对照组相比,MCF7/pDR-GFP/dp53细胞对照组HR效率增加49%(P<0.05),表明p53缺欠可引起HR修复效率增强;在此基础上进一步给予VPA处理,细胞HR效率降低20.3%,但与MCF7/pDR-GFP/wtp53细胞VPA组相比仍升高80.3%(P<0.05)。在MCF7/pDR-GFP/dp53细胞中,HR修复能力呈现过度增强,导致VPA对乳腺癌的放射增敏作用受到抑制。5.p53通过BRCA1-RAD51介导的HR修复机制影响VPA对乳腺癌细胞放射增敏作用根据免疫荧光检测HR修复关键蛋白BRCA1和RAD51在细胞核内的蛋白焦点形成情况。在wtp53表达的细胞中,与IR组相比,VPA+IR组BRCA1和RAD51焦点阳性细胞百分率分别下降15.6%和20.4%(P<0.05),说明IR激活的HR修复通路被VPA抑制。在dp53表达的细胞中,与wtp53细胞IR组相比,IR组含BRCA1和RAD51焦点阳性细胞百分率分别提高3 1.7%和27.6%(P<0.05),HR修复能力呈现过度增强;如若联合VPA处理后,VPA+IR组含BRCA1和RAD51焦点阳性细胞百分率较IR组虽略为降低,但仍分别高于wtp53细胞VPA+IR组41.5%和39.4%(P<0.05),HR修复能力仍呈现过度增强。结果提示,p53缺欠通过增强BRCA1-RAD51介导的HR能力抑制VPA的放射增敏作用。结论1.p53表达缺欠抑制VPA对IR诱导乳腺癌细胞核内的DNA DSBs的进一步蓄积作用。2.p53表达缺欠时,VPA对乳腺癌细胞的放射增敏性受到抑制。3.p53缺欠所致的VPA放射增敏作用下降机制与BRCA1-RAD51介导的HR修复功能的增强有关。