【摘 要】
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TNFRⅡ-FC是是TNFⅡ受体蛋白的膜外区与人IgG1的Fc段融合蛋白构成的二聚体。目前临床上主要用于类风湿关节炎(RA)的治疗,商品名Enbrel。Enbrel可结合血清中的可溶性TNF,并由此阻断其与细胞表面TNF受体的结合,抑制由TNF受体介导的异常免疫反应及炎症过程。Enbrel含934个氨基酸,分子量为150kd。目前由哺乳动物细胞表达系统生产。哺乳动物细胞表达系统高昂的费用和较低的表
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TNFRⅡ-FC是是TNFⅡ受体蛋白的膜外区与人IgG1的Fc段融合蛋白构成的二聚体。目前临床上主要用于类风湿关节炎(RA)的治疗,商品名Enbrel。Enbrel可结合血清中的可溶性TNF,并由此阻断其与细胞表面TNF受体的结合,抑制由TNF受体介导的异常免疫反应及炎症过程。Enbrel含934个氨基酸,分子量为150kd。目前由哺乳动物细胞表达系统生产。哺乳动物细胞表达系统高昂的费用和较低的表达水平,成为Enbrel及其他类似生物药物大规模生产和应用的制约因素。毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是上世纪80年代初期发展起来的一种外源蛋白表达系统。具有操作简易、易于培养、生长速度快、表达量高、成本低等优点。然而毕赤酵母表达蛋白的糖链结构是高甘露糖型结构,和人的糖链结构不同,这影响了毕赤酵母作为载体表达重组糖蛋白的应用。随着对毕赤酵母糖基化途径改造取得重大进展,应用毕赤酵母表达系统生产重组糖蛋白成为可能。透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin)是第一个在细菌中发现的血红蛋白。VHb与氧结合可以形成氧合态,介入细胞与氧有关的代谢途径,从而改变低氧时细胞原有的代谢方式。VHb可以使宿主细胞在低氧条件下能够良好生长,在多种原核和真核细胞中显示了提高菌密度,氧代谢和产率的作用。在本研究中,首先,将TNFRⅡ-FC序列插入到毕赤酵母质粒pPICZαA中,得到TNFRⅡ-FC表达载体,转入毕赤酵母菌GS115中,得到表达TNFRⅡ-FC的毕赤酵母工程菌,命名为GE。蛋白的表达经SDS-PAGE和Western blot确定。并经Protein A亲和层析纯化。将质粒pPIC9的AMP抗性基因片段插入到质粒pPICZα相应位点,并插入VHb序列,构建VHb表达载体。转入工程菌GE。得到毕赤酵母工程菌GE-VHB。以吸光度OD600nm值检测菌密度,菌液上清作Western blot分析,Bandscan分析蛋白含量,观察VHb其对工程菌株的生长和蛋白表达的影响。结果显示,在正常组和低氧组,均发现VHB对生长和蛋白表达有促进作用,尤其是低氧组,提高的更为明显。本研究在毕赤酵母中表达了TNFRⅡ-FC融合蛋白,可以作为应用毕赤酵母表达此类药物的参考。通过整合入VHb,发现VHB在正常和低氧条件下均能够促进菌体的生长和蛋白的表达。这为发酵过程中的供氧不足问题提供了一个有效的解决方法。
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