hBMP-7在毕赤酵母中高效表达及二聚体化研究

来源 :福建师范大学 | 被引量 : 3次 | 上传用户:gjb649666926
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骨形态发生蛋白(Bone Motphogenetic Proteins,BMPs)属于TGF-B家族的一类蛋白质生长因子,其中hBMP-7(又称OP-1),除了具有常位/异位诱导骨形成的作用以外,在发育过程中还能对多种组织器官的发生、发育起到重要的调节作用。因此,hBMP7在阐明多种组织器官的发生、发育分子机制的研究及在临床上具有广泛的应用前景。巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是近年发展起来并被广泛运用的一种优良的真核表达系统。本研究利用此表达系统表达hBMP-7,探讨在此表达系统中提高hBMP-7基因的拷贝数能否提高hBMP-7表达量,以及研究在此表达系统中表达高生物活性的hBMP-7二聚体蛋白的可行性。 主要研究内容和结论如下: 1、改造hBMP-7成熟肽的密码子,将酵母使用频率较低的密码子突变为使用频率较高的密码子,然后在hBMP-7成熟肽的N端带上a-factor的前-前导肽,接着构建表达载体pAO815-a-factor-BMP7m-1c(1拷贝),在此基础上,构建多拷贝hBMP-7成熟肽的表达质粒。将表达质粒转化GS115菌株,并进行摇瓶表达目的蛋白的实验,取上清经DOT-BLOT快速半定量检测,初步的实验结果表明,随着hBMP-7成熟肽基因拷贝数的增加,hBMP-7成熟肽在酵母中的表达量也增多。 2、把hBMP-7中FURIN识别的序列-RSIR-,应用SOEPCR的方法进行定点突变,改为酵母的Kex2p识别的序列-KR-,接着构建pPIC9K-BMP-7pmk表达载体。表达载体转化GS115菌株后,进行摇瓶培养表达目的蛋白的实验,表达产物经DOT-BLOT和WESTERN-BLOT分析,初步的实验结果表明,表达产物中无hBMP-7二聚体蛋白,说明用这种方法在酵母表达系统中无法获得hBMP-7二聚体蛋白。 3、利用pfuDNA聚合酶将hBMP-7的前导肽与成熟肽的基因扩增出来,构建表达载体pPIC9K-BMP-7pm;构建表达载体pAO815-Furin;接着将两种质粒共转化GS115菌株,筛选出同时含有这两种基因的菌株,为研究这两种蛋白同时在GS115菌株中表达打下基础。
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