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目的(1)观察自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat, SHR)和其对照组WKY大鼠(wistar-kyoto rat)的血压、体重以及心室重构的差别,以探讨SHR的病理生理特点。(2)观察依那普利对SHR血压、心室重构的影响。(3)观察SHR和WKY大鼠心脏的血管紧张素转换酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)和血管紧张素转换酶2(ACE2)的mRNA和蛋白质表达的差别,探讨ACE和ACE2在SHR高血压发生发展当中的作用。(4)观察依那普利对SHR心脏ACE和ACE2的mRNA及蛋白质表达的影响,探讨ACE及ACE2在依那普利降压机制中的作用。方法(1) SHR的分组及药物干预:将15只SHR随机分为2组:SHR对照组(n=7)和依那普利组(n=8),分别给以安慰剂、依那普利15mg.kg-1.d-1灌胃干预4周,干预过程中每周测量体重并根据体重调整给药量。同时取10只WKY大鼠作为正常血压对照组。(2)血压的测量:用无创尾动脉血压代表收缩压水平。干预过程中每周测量一次,方法为尾套间接测量法。(3)大鼠的处死及标本的采取:干预结束后腹腔注射戊巴比妥钠以麻醉大鼠,剪开胸腔,取出心脏,分离左心室。剪下小块左心室组织,用福尔马林浸泡,以备免疫组化使用。剩余组织冻存于液氮中,以用作逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)和western blot蛋白质免疫印迹检测。(4)左心室重量(left ventricular mass,LVM)及左心室重量指数(left ventricular mass index,LVMI):两项指标可反应左室重构的情况。LVMI是左心室的重量与体重的比值。大鼠处死前称量其体重,处死后分离左心室,精确测量LVM,然后计算出LVM与体重的比值(mg/g)即得LVMI。(5)心肌组织ACE及ACE2的mRNA的RT-PCR检测:用Trizol提取标本的总RNA,测定总RNA浓度。所有标本取4μg的总RNA作为模板逆转录cDNA,然后用3μl cDNA产物做ACE、ACE2及参照基因延长因子1α(elongation factor 1α,EF1α)的PCR扩增,扩增的DNA产物进行琼脂糖凝胶电泳,然后测定电泳条带的光密度(optical density,OD)值,用目的基因和EF1α基因的OD值的比值代表目的基因的相对表达含量。(6)心肌组织ACE及ACE2的western blot蛋白质免疫印迹检测:取少量心肌组织,置于预先加有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液中,剪碎,匀浆,提取膜蛋白。用考马斯亮兰法测定总蛋白浓度。每个标本取含有10μg总蛋白的裂解匀浆产物进行十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),然后转移至硝酸纤维素膜上,进行ACE、ACE2及参照蛋白β-actin的western blot免疫印迹,然后对硝酸纤维素膜进行化学发光,X光片显影,对X光片中的目的蛋白及β-actin的条带进行灰度分析,用目的蛋白和β-actin的灰度值的比值代表目的蛋白的相对表达含量。(7)心肌组织ACE及ACE2的免疫组织化学染色:染色方法为链霉亲合素-生物素复合物(streptavidin-biotin complex,SABC)法。石蜡切片在二甲苯及降序梯度酒精溶液中常规脱蜡至水,过氧化氢(H2O2)灭活内源性酶,然后用兔血清封闭液封闭,加一抗,生物素化二抗及SABC,之后用二氨基联苯胺(diaminobezidin,DAB)显色剂显色。然后升序梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片,显微镜观察。(8)统计学方法:全部数据采用SPSS 11.0统计软件包处理,计量数据以x±s表示。两组间比较采用t检验。三组及三组以上比较用方差分析。P<0.05为有统计学显著性差异。结果(1) SHR和WKY大鼠体重和血压的比较: 16周龄时SHR组的体重低于WKY组(380±23g vs 339±21g, P<0.05),但血压显著高于WKY组(191±19 mmHg vs 122±14mmHg,P<0.01)。20周龄时SHR组体重仍然低于WKY组(415±25g vs 376±20g,P<0.01),血压也依然明显高于WKY组(187±11 mmHg vs 116±4mmHg, P<0.01)。(2) SHR的心室重构及受依那普利的影响:SHR对照组的LVM和LVMI皆显著高于WKY组(1102±81 mg vs 782±24 mg,P<0.01;2.96±0.17mg/g vs 1.88±0.12 mg/g,P<0. 01)。依那普利组的LVM和LVMI都明显低于SHR对照组(906±128mg vs 1102±81 mg,P<0.01;2.43±0.29 mg/g vs 2.96±0.17 mg/g,P<0. 01),但二者都仍大于WKY组(906±128mg vs 782±24mg,P<0.05;2.43±0.29 mg/g vs 1.88±0.12 mg/g,P<0. 01)。心肌组织的HE染色显示,SHR对照组心肌纤维较WKY组心肌纤维明显肥大,而依那普利组的心肌纤维较SHR对照组明显纤细,较为接近WKY组。(3)16-20周龄间,SHR对照组、WKY组和依那普利组血压的演变:SHR对照组在16-20周龄间的五次血压依次为188±24mmHg、187±17 mmHg、189±18 mmHg、185±15 mmHg、187±11 mmHg,方差分析显示无明显变化(P>0.05)。WKY组大鼠的五次血压依次为122±14 mmHg、124±10 mmHg、118±13 mmHg、120±15 mmHg、116±4 mmHg,亦无显著变化(P>0.05)。依那普利组用药后第一周血压下降最为明显,平均降幅达45 mmHg(150±11 mmHg vs 195±16mmHg,P<0.01)。第二周末、第三周末、第四周末的血压分别为140±9 mmHg、140±12 mmHg、138±11 mmHg,前后相邻两组间相比皆无显著性差异(P>0.05)。依那普利组干预结束后的末次血压较SHR对照组明显降低(138±11 mmHg vs 187±11 mmHg, P<0.01),但尚未达到WKY组的血压水平(138±11 mmHg vs 116±4mmHg,P<0.01)。(4) SHR和WKY组心脏ACE和ACE2的mRNA和蛋白质表达:SHR对照组心脏的ACE的mRNA和蛋白质的表达都显著高于WKY组(ACE/EF1α:1.68±0.34 vs 0.33±0.12,P<0.01;ACE/β-actin:1.21±0.14 vs 0.71±0.11,P<0.01),而ACE2的mRNA和蛋白质的表达皆显著低于WKY组(ACE2/EF1α:0.50±0.15 vs 1.16±0.24,P<0.05;ACE2/β-actin:0.71±0.24 vs 1.22±0.14,P<0.05)。(5)依那普利对SHR心脏ACE和ACE2的mRNA和蛋白质表达的干预:干预后依那普利组ACE的mRNA和蛋白质的表达明显低于SHR对照组(ACE/EF1α:0.44±0.19 vs 1.68±0.34,P<0.01;ACE/β-actin:0.87±0.13 vs 1.21±0.14,P<0.05),已经降至和WKY组相当的水平(ACE/EF1α:0.44±0.19 vs 0.33±0.12,P>0.05;ACE/β-actin:0.87±0.13 vs 0.71±0.11,P>0.05)。干预后依那普利组ACE2的mRNA表达明显高于SHR对照组(ACE2/EF1α: 1.77±0.49 vs 0.50±0.15,P<0.01),且已高出了WKY组的水平(ACE2/EF1α: 1.77±0.49 vs 1.16±0.24,P<0.05),而ACE2蛋白表达和SHR对照组无差别( ACE2/β-actin:0.42±0.22 vs 0.71±0.24,P>0.05 ),仍明显低于WKY组的表达水平( ACE2/β-actin:0.42±0.22 vs 1.22±0.14,P<0.01 )。(6)在SHR和WKY的心脏组织,ACE和ACE2主要表达在心肌细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞的细胞膜上。SHR心肌的ACE的免疫表达明显高于WKY组,ACE2的免疫表达明显低于WKY组。依那普利能降低SHR心肌ACE的免疫表达,但对ACE2的免疫表达没有影响。结论(1)SHR的血压较同龄的对照品系WKY大鼠高,而体重较轻。其血压在16-20周龄之间保持稳定,无明显演变。(2)相对于同龄的对照品系WKY大鼠,20周龄的SHR的左室心肌明显肥大,LVM和LVMI显著升高,有明显的心室重构。(3)15mg.kg-1.d-1剂量的依那普利能显著降低SHR血压,逆转心室重构。(4)SHR心脏ACE的mRNA和蛋白质表达显著升高,ACE2的mRNA和蛋白质表达显著降低,ACE和ACE2之间这种平衡的失调可能是SHR高血压形成的机制之一。(5)依那普利能显著降低SHR心脏ACE的mRNA和蛋白质的表达,显著升高ACE2的mRNA水平,而对ACE2蛋白质表达没有明显影响。依那普利对ACE和ACE2的这种影响可能是其作用机制之一。(6)在SHR和WKY的心脏组织,ACE和ACE2主要表达在心肌细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞的细胞膜上。总之本文研究的目的,在于探讨ACE2存在的意义。研究表明在自发性高血压大鼠中显示ACE升高,ACE2降低,依那普利降低ACE。提示ACE2与ACE是一对对立物而存在于RAS系统,二者动态平衡协调RAS活性。在今后RAS研究中不可忽视ACE2。