研究背景与目的： 前列腺癌是男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤，其发病率居男性恶性肿瘤的第一位，死亡率居第二位，在中国近年来有迅速上升的趋势。前列腺癌的传统疗法例如手术、放疗等只对早期、局限性前列腺癌有效，对手术后复发、激素非依赖性及转移性前列腺癌疗效很差，因此，迫切需要寻找新的治疗方法。 靶向性免疫治疗是目前非常有应用前景的肿瘤治疗策略。构建有效的免疫治疗用肿瘤疫苗要满足两个条件：1、肿瘤特异性／相关性抗原；2、能刺激机体产生有效的T细胞免疫应答。前列腺特异性膜抗原(PSMA)具有良好的免疫原性，它高表达于前列腺癌，尤其在低分化、激素非依赖性及转移性前列腺癌中表达进一步增高。因此，PSMA作为一个与前列腺癌疾病进程密切相关的膜抗原已成为前列腺癌有效的治疗靶点。目前基于PSMA构建的肿瘤疫苗主要有树突状细胞(dendritic cell，DC)疫苗、DNA疫苗、蛋白质疫苗及多肽疫苗，然而综合考虑疫苗构建的技术难度、经济成本、有效性及安全性等因素，上述疫苗仍存在明显不足。因此，如何采用简单易行的技术方法，构建一种既能有效加载PSMA蛋白，又能发挥佐剂效应显著提高PSMA的免疫原性，从而刺激有效的T细胞免疫应答的前列腺癌疫苗成为目前研究的热点。 目前已证实酿酒酵母作为一种生产简单及安全有效的真核表达系统，不仅可以完成外源性抗原的加载与修饰，而且可以发挥其免疫佐剂效应增强DC等抗原呈递细胞对外源性抗原的提呈作用，从而刺激机体产生特异的细胞毒性T淋巴细胞反应(CTL)，最终有效杀伤肿瘤细胞。这已经在淋巴瘤、肺癌、黑色素瘤的动物模型中得到证实。然而，酿酒酵母是否也可以有效加载PSMA蛋白，从而刺激机体产生有效的免疫应答，特异性杀伤表达PSMA的肿瘤细胞呢?目前尚未有PSMA加载酿酒酵母用于前列腺癌治疗的研究，这正是本论文研究的主要问题。因此，本论文研究目的如下：克隆PSMA编码区基因全长，转化酿酒酵母并诱导表达，完成：PSMA酵母疫苗的构建；建立表达PSMA的黑色素瘤细胞系(B16F10-PSMA)，经皮下接种完成表达PSMA的黑色素瘤小鼠模型的构建；体内实验证实PSMA酵母疫苗抗瘤效果的特异性和有效性。本研究为基于PSMA进行前列腺癌疫苗的研制提供了新的思路，并为其在前列腺癌预防和治疗中的应用提供了充分的实验依据。 方法： 一、pYES2／NT C-PSMA酵母重组质粒的构建： PCR扩增PSMA编码区基因全长(含BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点，不含终止密码子)，经酶切连接插入酿酒酵母表达质粒pYES2／NT C相应的酶切位点，应用菌落PCR、双酶切及测序进行验证。 二、pYES2／NT C-PSMA在酿酒酵母中的诱导表达： 转化pYES2／NT C-PSMA重组质粒至酿酒酵母菌株INVSc1中，Sc-ura培养板进行筛选获得酵母阳性克隆；酵母重组质粒抽提后PCR法验证阳性克隆；含2％半乳糖的酵母诱导培养基诱导阳性克隆中PSMA的蛋白表达，Western-blot进行鉴定。 三、B16F10-PSMA的建立： 脂质体转染法将包含有PSMA cDNA序列的pcDNA3.0重组质粒转染入黑色素瘤细胞系B16F10，G418筛选后获得稳定生长的阳性克隆细胞，RT-PCR、Westem-blot检测PSMA的表达。 四、PSMA酵母疫苗的体内治疗和免疫预防研究： (1)治疗效应的研究： 4-6周C57BL/6雄性小鼠接种B16F10-PSMA后4d，9d，15d，分别给予PBS、INVSc1、INVSc1-PSMA治疗后，进行以下指标的检测：测量肿瘤体积及重量；间接免疫荧光检测血清中抗PSMA抗体；MTT检测T细胞增殖率；免疫组化显色肿瘤组织中T淋巴细胞；ELISA法对血清中的IL-12、IFN-γ进行定量分析。另外，接种不表达PSMA的B16F10细胞做为非特异行对照。 (2)免疫预防效应的研究：4-6周C57BL／6雄性小鼠分别用PBS、INVSc1、INVSc1-PSMA连续免疫3周，接种B16F10-PSMA，观察指标基本同治疗效应研究，并同时进行小鼠生存率及成瘤时间的比较。同样以接种不表达PSMA的B16F10细胞做为非特异性对照。 结果： 一、pYES2／NT C-PSMA的构建： 菌落PCR法、双酶切及测序法证明PSMA cDNA序列正确插入了pYES2／NTC中。 二、PSMA蛋白在INVSc1中的诱导表达： 选取酵母重组质粒抽提后PCR法验证为阳性的克隆，增菌诱导后，Western-blot证实约100KD的PSMA成功在INVSc1中表达。 三、B16F10-PSMA的建立： RT-PCR、Western-blot证实成功构建了表达PSMA的黑色素瘤细胞系B16F10-PSMA。 四、PSMA酵母疫苗的体内治疗和免疫预防效果： (1)治疗效应：PBS组、INVSc1组及INVSc1-PSMA组接种B16F10-PSMA和非特异性对照组接种B16F10细胞后，INVSc1-PSMA组成瘤率为87.5％，其它三组均为100％。INVSc1-PSMA组肿瘤平均体积和平均瘤重为0.19cm3，(0.34+0.08g)；而PBS组、INVSc1组及非特异性对照组的平均体积和平均瘤重分别为0.76 cm3，(1.08±0.39g)：0.52 cm3，(0.50±0.19g)和0.75 cm3，(1.55+0.24g)；均明显比INVSc1-PSMA组大(P<0.05)。只有INVSc1-PSMA组可以产生抗PSMA的抗体。INVSc1-PSMA组的T淋巴细胞增殖率明显高于PBS及INVSc1组(P<0.05)。INVSc1-PSMA组的肿瘤组织内T细胞数目显著多于其它三组。PBS组、INVSc1、INVSc1-PSMA组小鼠血清中IL-12的分泌量分别为(38.33±2.09 pg／ml)、(50.37+1.71 pg／ml)和(210.73+5.66 pg／ml)，IFN-γ的分泌量别为(65.27+2.89 pg／ml)、(84.23+4.64 pg／ml)、(483.6+8.83 pg／ml)，可见INVSc1-PSMA组IL-12和IFN-γ的分泌量明显升高(P<0.05)。 (2)免疫预防效应：INVSc1-PSMA组的成瘤时间明显推迟(P<0.05)，平均为(18.57±2.44天)，其它三组分别为(10.8±1.2天)、(11.6±0.98天)和(11.5±0.82天)。PBS组、INVc 1组、INVSc1-PSMA组及非特异性对照组的生存率分别为20％、40％、87.5％和25％，可见INVSc1-PSMA组可以使小鼠的生存率明显提高(P<0.05)。INVSc1-PSMA组的平均肿瘤体积为0.31cm3，而PBS组、INVc1组及非特异性对照组分别为1.23cm3、0.63cm3和1.79cm3，明显比INVSc1-PSMA组大(P<0.05)。只有INVSc1-PSMA组可以产生PSMA特异性抗体。INVSc1-PSMA组的T细胞增殖率明显高于PBS及INVSc1组(P<0.05)。INVSc1-PSMA组的肿瘤组织内T细胞数目显著多于其它三组。INVSc1-PSMA组IL-12和IFN-γ的分泌量分泌量分别为(IL-12：423.83±14.61 pg／ml；IFN-γ：840.5.17±15.07 pg／ml)，明显高于PBS组(IL-12: 41.8±2.39 pg／ml:IFN-γ：107.1±5.84 pg／ml)和INVSc1组(IL-12: 63.67±4.44 pg／ml；IFN-γ：143.43±14.62pg／ml)(P<0.05)。 结论： 1.成功构建表达PSMA的新型酿酒酵母肿瘤疫苗(INVSc1-PSMA)，为前列腺癌疫苗的研究提供了一条新思路。 2.成功构建表达PSMA的小鼠移植瘤模型。 3.PSMA新型酿酒酵母疫苗可刺激机体产生有效的体液及细胞免疫应答，特异性抑制表达PSMA的肿瘤细胞生长，可有望成为有效预防和治疗前列腺癌的新方法。