肺缺血再灌注（ischemia/reperfusion,IR）损伤是多种外科手术,如肺移植、体外循环术、肺动脉血栓或栓子切除术后的严重临床并发症,拥有较高死亡率。近几十年来的基础研究和临床实验揭开了其部分复杂病理机制下的面纱,主要包括氧化应激、炎症反应和细胞死亡等。G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor,GPCR）是介导细胞外配体信号传导的最大受体家族之一,在感染和无菌性炎症疾病中发挥重要的调节作用。其磷酸化主要由G蛋白偶联受体激酶（G protein-coupled receptor kinase,GRK）介导。肺缺血再灌注损伤发生后,GPCR在多种炎症因子、氧化应激产物的作用下被持续激活,因而在GRK调控下出现受体脱敏、内化,并最终影响疾病转归。实验室前期研究发现GRK4过表达加重缺血引起的心肌细胞损伤。然而,GRK4在肺缺血再灌注损伤中的作用仍不清楚。由于氧化应激是介导缺血再灌注损伤发生的重要危险因素,近年来随着天然化合物的抗氧化活性被广泛研究,迷迭香酸（rosmarinic acid,RA）作为一种天然的酯类化合物受到越来越多的关注。在临床工作中,迷迭香酸常被用于治疗消化性溃疡、关节炎、白内障、癌症、类风湿关节炎、支气管哮喘等疾病。回溯既往研究,我们发现迷迭香酸具备多种生物学活性,例如抗氧化和抗炎等,其抗氧化活性位于羟基肉桂酸之首。既往研究证实迷迭香酸通过抗氧化作用对心脏、肝脏和大脑缺血再灌注损伤发挥极强的保护效应。深究其抗氧化能力,其一方面直接通过邻苯二酚羟基清除细胞内的自由基,另一方面通过间接调节NADPH氧化酶（NOX）和超氧化物歧化酶（SOD）的含量。因此,我们拟利用迷迭香酸的抗氧化效应治疗肺缺血再灌注损伤,并对其保护机制进行深入探讨,旨在为临床缺血再灌注损伤的治疗提供新的方案。方法:1.GRK4保护肺缺血再灌注损伤建立C57BL/6J小鼠肺缺血再灌注损伤模型,通过蛋白免疫印迹实验（Western blot）检测组织层面的GRK家族蛋白的表达量变化。构建GRK4过表达小鼠,在琼脂糖凝胶电泳进行基因鉴定后,建立肺缺血再灌注模型,为明确GRK4在损伤中的作用,检测了小鼠肺湿干比、动脉氧分压（PaO2）、二氧化碳分压（PaCO2）、血清炎症指标（IL-1β、IL-6）、组织氧化应激（DHE染色）,绘制生存率曲线,并进行病理切片（H＆E染色）分析。2.GRK4通过抑制肺泡上皮细胞内质网应激发挥肺缺血再灌注损伤保护作用2.1为分析GRK4过表达对缺血再灌注损伤后凋亡水平的影响,通过TUNEL染色以及定量分析凋亡信号通路（BAX、BCL-2、Active caspase 3）的表达进行综合判断。2.2为明确GRK4在缺血再灌注损伤前后于肺泡上皮细胞的分布,在肺组织切片上使用GRK4与Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮的标志蛋白进行免疫荧光共染色。并进一步确认过表达GRK4发挥保护效应的细胞类型。2.3为鉴别GRK4在缺氧复氧后参与的内源性凋亡途径,使用定量（检测线粒体和内质网GRK4含量）及定位（免疫荧光共染色）实验明确GRK4在缺氧复氧后与线粒体和内质网的关系。2.4检测GRK4对内质网应激（PERK、IRE1、ATF6）及其下游凋亡通路（Active caspase 9、Active caspase 12、ATF4）的影响。3.迷迭香酸改善肺缺血再灌注损伤的作用和机制研究3.1 为明确迷迭香酸在肺缺血再灌注损伤中的作用,C57BL/6J小鼠提前7天每天进行迷迭香酸灌胃（50、75或100 mg/kg）,建立肺缺血再灌注损伤模型,检测小鼠肺湿干比、动脉氧分压、二氧化碳分压、计算氧合指数筛选最佳浓度（75 mg/kg）。使用该浓度再次构建缺血再灌注损伤模型,分析病理切片（H＆E染色）,绘制生存曲线,检测血清炎症因子（IL-1β和IL-6）,组织氧化应激（DHE染色、MDA水平、SOD和NOX活性及NOX2/4,SOD1/2表达量）和凋亡（TUNEL染色,Active caspase 3表达量）水平。3.2为验证迷迭香酸在肺泡上皮细胞（A549细胞）的作用,迷迭香酸24 h预处理后在肺泡上皮细胞（A549细胞）建立缺氧复氧模型,通过细胞活力实验（CCK-8）筛选最佳处理浓度（15 μM）。后使用迷迭香酸预处理（15μM）检测其对氧化应激（DHE染色、MDA水平、SOD和NOX活性检测）和凋亡（TUNEL染色）的影响。并在大鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞（RLE-6TN）上重复LDH检测和DHE的染色结果。3.3为探究迷迭香酸保护缺血再灌注损伤的机制,首先在体外明确PI3K/Akt通路（使用wortmannin,PI3K抑制剂）在迷迭香酸调节氧化应激（NOX2/4,SOD1/2）、凋亡（BCL-2,BAX,Active caspase 3）中的作用。并在体内通过检测小鼠肺湿干比、动脉氧分压、二氧化碳分压,计算氧合指数、分析肺组织的炎症因子水平（IL-1β和IL-6）以及病理切片验证体外实验结论。结 果:1.构建C57BL/6J小鼠肺缺血再灌注损伤模型,发现GRK2、GRK3、GRK4蛋白表达增加,GRK5表达量降低,GRK6变化不显著,其中GRK4是GRK蛋白家族中变化最明显的成员,这表明GRK4可能与缺血再灌注损伤的相关性最大。因此构建GRK4过表达小鼠,造模后发现GRK4过表达显著改善缺血再灌注损伤导致的肺水肿（肺湿干比）、低氧血症（PaO2、PaCO2）、组织结构破坏（H＆E染色）,降低组织氧化应激和凋亡水平,并最终提高生存率。2.通过在GRK4过表达小鼠构建肺缺血再灌注损伤模型,我们发现GRK4过表达显著减少细胞凋亡,并抑制凋亡相关分子（BAX、BCL-2、Active caspase 3）表达。进一步分析GKR4的肺组织定位明确其在肺泡上皮主要组成细胞（Ⅰ型和Ⅱ型肺泡上皮）均有分布,且过表达GRK4主要降低Ⅰ型肺泡上皮在缺血再灌注损伤期间的凋亡。深入研究发现GRK4在缺氧复氧后主要富集于内质网,并在过表达GRK4时抑制内质网应激（PERK、IRE1、ATF6）及其下游凋亡通路（Active caspase 9、Active caspase 12、ATF4）的激活,相反,敲低GRK4后该通路进一步激活。3.迷迭香酸（75 mg/kg）预给药改善缺血再灌注损伤导致的小鼠肺水肿（肺湿干比）、低氧血症（PaO2、PaCO2）、组织结构破坏（H＆E染色）,降低组织氧化应激和凋亡水平,并最终提高生存率。进一步研究发现迷迭香酸在缺氧复氧中通过PI3K/Akt信号通路调控 NOX2/4 和 SOD1/2,抑制细胞凋亡信号（BCL-2,BAX,Active caspase 3）,而wortmannin（PI3K抑制剂）的加入抵消了迷迭香酸的保护作用。结论:1.GRK4通过减轻氧化应激与炎症保护肺缺血再灌注损伤。2.GRK4抑制Ⅰ型肺泡上皮细胞的内质网应激及其下游凋亡通路发挥保护作用。3.迷迭香酸激活PI3K/Akt通路下调氧化应激和凋亡水平,保护肺缺血再灌注损伤。