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研究背景：近年来，乳腺癌的发病率逐年上升，且呈现低龄化趋势，严重危害女性的身体和心灵健康。结合乳腺癌易患病因素，从癌基因异常表达入手，阐明乳腺癌的分子病理机制，探索新的诊断和治疗靶点，将为乳腺癌的治疗带来突破性进展。FTO（肥胖相关基因）含Fe(II)-和2-氧化戊二酸(2OG)-依赖的加氧酶的序列基序，为ALKB蛋白家族成员之一。FTO缺陷动物模型的表型以及FTO基因SNP与疾病的关联研究表明FTO不仅与肥胖、糖尿病密切相关，还与中枢神经系统、心脏等器官的发育及相关疾病有关。临床研究表明FTO基因外显子1的4个SNPs均与乳腺癌相关，且提供有效的分类标识预测乳腺癌的危险性，这些研究均表明FTO的突变和异常表达可能与乳腺癌的发生发展密切相关，然而其中涉及的分子机制仍然有待阐明。DNA损伤修复被认为与肿瘤的发生密切相关，染色体DNA在减数分裂和同源DNA修复中，会形成一个被称为“霍利迪连结体”（Holliday结构）的四链DNA中间体，人体中的“霍利迪连结体”解离酶被称为GEN1，具有分解霍利迪连接体，进而保证DNA顺利修复的功能，在乳腺癌患者中发现GEN1存在突变，然而大量样本研究表明乳腺癌患者与对照者中GEN1的SNPs频率（6个tag SNPs标记GEN1转录区域的30个常见突变）无显著差异，常见GEN1突变不能作为肿瘤的易感微效基因，然而对于GEN1在乳腺发育和乳腺癌发生过程中的具体生物学功能，及其分子机理尚不清楚。迫切需要进一步深入探索。研究目的：1.明确FTO、GEN1在乳腺发育和乳腺癌发生、发展中的生物学作用；2.探讨FTO、GEN1在乳腺细胞中的亚细胞定位及与其生物学功能的关系；3.临床标本中观察FTO基因表达与乳腺癌恶性分化、转移等恶性生物学特征的关系；4.揭示GEN1参与乳腺癌DNA损伤修复，FTO参与乳腺癌组蛋白甲基化等生命过程的分子机制。研究方法：1.取出雌性小鼠不同阶段（青春期、妊娠期、哺乳期、退化期）的乳腺组织，采用荧光定量PCR、western blot、免疫组化方法分别检测FTO、GEN1基因在乳腺发育不同阶段的表达水平；2.分离8周雌性小鼠乳腺上皮细胞，进行原代培养，免疫荧光分析FTO、GEN1的亚细胞定位；3.选取乳腺腺瘤、三阴性乳腺癌、转移性乳腺癌及相关淋巴结转移癌组织的石蜡标本，免疫组化方法观察FTO基因表达；4.采用在乳腺癌细胞中对FTO进行瞬时抑制，通过免疫荧光分析，探讨FTO与乳腺细胞组蛋白甲基化的关系；采用western blot分析乳腺发育不同阶段的组蛋白甲基化水平；5.利用DNA损伤模型，探讨GEN1对于乳腺癌细胞DNA损伤修复的影响。研究结果：1.FTO和GEN1在乳腺发育的不同阶段，表达量存在特异性的变化：在青春期FTO的表达基本稳定，进入妊娠期后FTO的表达稍有升高，哺乳期FTO的表达量显著减少，进入退化期后FTO表达量逐渐升高，联系到FTO与脂肪代谢的关联，可以推测FTO与调节哺乳和乳液分泌及消退等生理活动有着重要作用；GEN1的表达随乳腺的发育而存在显著变化，在青春期向妊娠期转变的过程中逐渐增高，然后在哺乳期显著降低，退化期再次恢复性的增高，在妊娠中期和哺乳早期GEN1的表达呈现高峰。这种波动性的变化可能与乳腺组织DNA复制的活跃度相关。2.免疫组化结果显示FTO主要定位于乳腺上皮细胞的细胞核内，乳腺导管周围的肌皮细胞中未表达，原代乳腺上皮细胞的免疫荧光结果表明，乳腺上皮细胞的有丝分裂间期，FTO的表达主要定位于胞核，胞浆量分布较少；有丝分裂中期、末期，FTO主要定位于纺锤丝和胞浆，表达量有所提高，这提示FTO亚细胞定位转变可能参与乳腺上皮细胞的有丝分裂过程；结合FTO在乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231不同细胞周期中的变化情况，我们推测FTO对乳腺细胞周期变化的影响，与其亚细胞定位有关，而与其表达量变化关联性不大，然而在恶性程度高的乳腺癌细胞MDA-MB-231中S期FTO的表达稍高；3.临床石蜡标本的免疫组化结果显示FTO在乳腺腺瘤中呈高表达，而在转移性乳腺癌和三阴性乳腺癌中呈弱表达；通过siRNA的瞬时转染抑制FTO的表达；4.免疫荧光技术观察组蛋白H3K4甲基化（H3K4me3）的变化；western blot分析小鼠乳腺发育不同阶段中H3K4me3表达，结果表明，FTO表达水平与H3K4me3呈负相关，也提示了我们FTO的去甲基化作用在乳腺癌的发生、发展中也有着关键价值。5.GEN1的亚细胞定位于中心体，这与其参与DNA损伤修复的功能直接相关，同时提示我们GEN1可能影响乳腺上皮细胞的有丝分裂。5.乳腺癌细胞DNA损伤试验的结果表明在MCF-7细胞中，无论是ADR还是MMS处理，随着处理时间增加，即DNA损伤程度的增加，GEN1的表达量持续增加；而在MDA-MB-231中，GEN1的表达则出现明显波动，DNA损伤初期，GEN1的表达量上调，达到12h后，GEN1的表达量显著下降，这种变化可能与不同乳腺癌细胞对于DNA损伤耐受程度有关。这一结果说明GEN1在乳腺癌细胞对抗DNA损伤的过程中，可能有着重要的保护作用，其表达量升高与DNA损伤修复活动增强直接相关。研究结论：本研究在组织水平、细胞水平、动物水平和分子水平，开展了对于FTO、GEN1对于乳腺细胞发育和乳腺癌发生中的功能研究，明确了FTO和GEN1的亚细胞定位，发现其与乳腺发育相关，与乳腺上皮细胞的有丝分裂有关；FTO在三阴性乳腺癌和转移性乳腺癌中的表达降低，可能与乳腺癌患者的不良预后相关；在小鼠乳腺发育各阶段和乳腺癌细胞中，FTO表达水平与组蛋白甲基化负相关，提示FTO去甲基化作用可能影响乳腺发育及乳腺癌发生发展。GEN1的表达对于乳腺癌细胞对抗DNA损伤有着一定保护作用。研究有助于理解乳腺癌发生发展的新分子机制，为研究DNA损伤修复与乳腺癌发生的关联性研究提供了新线索。此外，本研究也为开发以FTO和GEN1为靶点的乳腺癌分子靶向治疗提供了理论依据和实验基础。