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角质细胞生长因子(keratinocyte growth factor,KGF)属于成纤维细胞生长因子家族,也叫FGF-7,它仅特异地刺激角质细胞和其他上皮细胞的增殖。研究发现KGF在生长期的毛乳头细胞表达,它与毛囊中的KGF受体特异性结合后可刺激皮肤毛囊的生长,这说明KGF具有支持毛囊生长的作用。毛囊特异性表达载体的构建和转基因动物模型作为研究基因功能的重要手段,可以用来探究该基因在小鼠毛囊发育过程中的作用和调控机制。为了阐明KGF在小鼠毛囊发育过程中的功能,本研究利用转基因技术,用脂质体转染法将毛囊特异性表达载体pCDsR-UKA导入到小鼠胚胎干细胞中,经G418筛选获得稳定表达KGF基因和红色荧光蛋白的转基因ES细胞。为建立KGF过表达的转基因小鼠提供核供体,从而为通过构建转基因小鼠模型来研究KGF基因对小鼠毛囊的作用提供研究基础。1.毛囊特异性表达载体pCDsR-UKA的构建利用RT-PCR技术从小鼠成纤维细胞总RNA中扩增小鼠角质细胞生长因子(KGF)编码区cDNA序列,以pBlue-T克隆载体为骨架构建中间载体pB-KGF。将UHS启动子和BGH polyA尾片段分别连接在pB-KGF载体的SacⅠ+XbaⅠ和EcoR V +Sal I位点,再将UHS+KGF+polyA基因片段连接在pCDsRed2表达载体的SacⅠ+SalⅠ位点,构建成毛囊特异性表达载体pCDsR-UKA (6.6 kb)。经酶切和DNA测序验证,本研究所构建的表达载体pCDsR-UKA结构与序列均与预期设计相符合。2.小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养与饲养层的制作通过单细胞接种法成功分离出13.5d的小鼠原代胚胎成纤维细胞,利用高糖DMEM+10%FBS培养液在37℃、5%CO2、100%湿度条件下体外培养和传代。P1-P3代小鼠胚胎成纤维细胞用20μg/mL丝裂霉素C处理后制作饲养层,将ES细胞传代在饲养层上,利用80%高糖DMEM+15%FBS+LIF胚胎干细胞培养液在37℃培养箱进行培养。同时绘制了小鼠第2代MEF和SNL细胞的生长曲线,并对ESC进行AKP染色、Oct-4和SSEA-1免疫荧光染色,以及制作并分析了ES细胞中期染色体核型。通过以上实验证明,培养的小鼠ES细胞在体外培养环境下克隆生长状态正常且并未分化,可以用于外源基因脂质体转染效率的研究。3.小鼠ES细胞的外源基因转染条件优化以及转基因ES细胞的筛选和鉴定本实验进行了G418对小鼠ES细胞的耐受性测定,浓度稀释梯度实验结果确定G418的最佳筛选浓度为800μg/mL,维持浓度为400μg/mL。用脂质体2000转染小鼠胚胎干细胞,分别对转染时的DNA浓度、脂质体剂量、转染孵育时间等条件进行了梯度优化,48h后统计不同组别的转染效率,得出最佳的转染条件。实验结果发现利用优化的脂质体转染悬浮ES细胞的条件,在6孔板中当DNA与脂质体比例为3：10时,可获得最高转染效率(34.4±4.1)%。对转染48小时后的ES细胞以800μg/mL G418为抗性筛选浓度,在胚胎干细胞培养液中于37℃培养箱里连续筛选培养4-5天,后换为400μg/mL G418维持筛选5-6天,获得了稳定表达红色荧光蛋白的转基因ES细胞克隆。通过对转基因ES细胞基因组DNA的PCR扩增检测,证实KGF基因已稳定整合在转基因ES细胞基因组中。同时对转基因ES细胞进行了染色体核型分析,碱性磷酸酶染色、Oct-4和SSEA-1免疫荧光染色,证明了转基因ES细胞在体外生长状态正常且并未分化,可以为四倍体囊胚提供供体ES细胞,制备ES小鼠模型,为进一步研究KGF对小鼠毛囊的促进和调控作用奠定了基础。