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研究背景：缺血性心肌病主要表现为心肌缺血或心肌梗死,随着人民生活水平的提高及社会竞争压力的增大,其发病率逐年上升并呈低龄化趋势。如何找到一种能够降低死亡率,改善心肌缺血及提高心肌梗死后心功能的治疗方法成为国内外研究的热点。近年来国内外研究报道,电针(EA)治疗缺血性心肌病有其独特的疗效,而下丘脑(Hypothalamus)及延髓头端腹外侧区(rostral ventrolateral medulla, RVLM)作为心血管调控的中枢部位可能参与其中,但其机制仍不是很清楚。1998年研究学者发现一种新的下丘脑神经肽-orexin,已报道其参与进食行为、能量平衡及睡眠-觉醒的调节,我们对其心血管调节特别有兴趣。近年研究证实,中枢活性氧(reactive oxygen species, ROS)参与交感兴奋所致的心血管效应。那么,中枢orexin是否参与了电针改善心肌缺血,而其调节作用是否与下丘脑和RVLM有关,中枢活性氧是不是介导了orexin对心肌缺血的调节作用,目前这些机制仍不是很清楚。目的：本课题通过建立急性心肌缺血(AMI)大鼠模型,观察电针内关穴对急性心肌缺血的改善作用,检测AMI组和AMI+EA大鼠心血管调节下丘脑外侧区的OXA及RVLM的OX1R的表达,并观察OXA阻断剂、ROS的清除剂及NADPH氧化酶的抑制剂在RVLM对OXA引起心血管效应的影响,同时检测RVLM氨基酸的释放改变,从而研究OXA调节中枢交感传出的主要中枢部位,以及与其他心血管调节中枢递质和调质的关系,以分析orexin调节心血管活动的作用途径,进一步探讨电针改善心肌缺血的中枢机制。方法：AMI大鼠模型采用结扎冠状动脉左前降支制备；大鼠针刺穴位选择双侧“内关”穴,针刺对照穴位选择双侧“列缺”穴；并监测大鼠心率(HR),平均动脉压(MAP),心室内压(IVP),观察AMI大鼠及其针刺后心功能各项指标的变化。采用氯化四唑(TTC)染色检测梗死心肌面积、苏木精和伊红(HE)染色观察梗死心肌组织形态以及超声心动图观察心脏的室壁结构。采用心率变异性(HRV)分析系统记录大鼠心脏自主神经功能状态,并通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定各组大鼠血浆去甲肾上腺素(NE)和肾上腺素(E)的含量。采用免疫组织化学(IHC)方法检测各组(对照组、AMI组、／AMI+EA内关组)大鼠下丘脑外侧区OXA和RVLM区OX1R的表达；采用蛋白免疫印迹法(westernblot)检测各组(对照组、AMI组、AMI+EA内关组)RVLM区OX1R蛋白的表达变化；采用荧光定量聚合酶链式反应(Realtime-PCR)观察各组大鼠下丘脑prepro-orexin(PPO)的mRNA表达变化；采用化学发光法测定各组大鼠RVLM区ROS的含量变化；采用激光共聚焦结合免疫荧光双标技术观察RVLM区OX1R与NADPH氧化酶亚单位p47phox及gp91phox的共表达；采用中枢核团RVLM微量注射的方法观察OXA对心功能指标的影响,及其阻断剂SB-408124、ROS的清除剂Tempol及NADPH氧化酶的抑制剂Apocynin对OXA心血管效应的影响；采用微透析结合高效液相色谱荧光检测技术(HPLC-FD),观察各组大鼠RVLM区氨基酸递质释放的改变。结果：(1)AMI模型制备：冠状动脉左前降支结扎后,大鼠立即出现心电图S-T段抬高,结扎线远端心肌发白,运动减弱,说明AMI模型制备成功。TTC及HE染色显示AMI后梗死心肌组织及EA后的改善状况,超声心动图显示AMI后左室内径增大室壁厚度变薄。(2)心功能指标监测：冠脉结扎5天后,AMI大鼠心率(HR)加快,左室舒张末期压力(LVEDP)升高,其他各项心功能指标,包括左室收缩末期压(LVSP)、左室压力最大上升速率(+dp/dtmax)、左室压力最大下降速率(-dp/dtmax)均显著降低(P<0.01,n=6)。电针AMI大鼠双侧“内关”穴后,其HR与LVEDP下降,其他各项心功能指标也均有明显改善(P<0.01,n=6)。而电针AMI大鼠双侧“列缺”穴与电针“内关”穴相比其心功能没有得到改善(P<0.05或P<0.01,n=6)。(3)心率变异性(HRV)监测及血清肾上腺素(E)与去甲肾上腺素(NE)含量测定：AMI大鼠HRV分析显示,其LF/HF明显升高,EA“内关”后可降低LF/HF比值(P＜0.05, n=6); AMI大鼠血清中NE与E明显增多(P<0.05,n=6),EA后两者含量明显降低。(4)免疫组织化学(IHC)结果显示,AMI大鼠HPO的OXA阳性神经元与RVLM的OX1R阳性神经元与对照组相比明显增多,包括相对光密度值及神经元个数(P<0.05,n=6),EA“内关”穴后两部位的阳性神经元明显减少(P<0.05,n=6),而EA“列缺”穴后两部位阳性神经元与AMI组相比无明显变化。(5) western blot结果显示,OX1R蛋白在各组大鼠RVLM均有表达；与对照组相比,AMI组大鼠RVLM的OX1R蛋白表达明显增多(P<0.01,n=4),EA后OX1R蛋白的表达可降低。(6) real-time PCR结果显示,各组大鼠下丘脑均有OXA表达；AMI组大鼠下丘脑的PPO mRNA与对照组相比明显增多(P<0.01,n=7),EA后可使其减少(P＜0.05, n=7)。(7)激光共聚焦结合免疫荧光双标结果显示,RVLM区OX1R与NADPH氧化酶的胞膜亚单位gp91phox及胞浆亚单位p47phox存在共表达(8)化学发光法测定ROS结果显示,AMI大鼠RVLM区ROS含量与对照组相比显著升高(P＜0.05, n=7), EA后可降低ROS的含量(P<0.05, n=7)。AMI大鼠侧脑室注射OXA (100pmol)后RVLM区ROS产生增多(P<0.05,n=4),注射SB (100pmol)、Tempol (50nmol)或Apo (5nmol)可阻断这种效应(P<0.05或,n=4)。(9)各组(对照组、AMI组、AMI+EA内关组)大鼠RVLM微量注射OXA及阻断剂SB后心功能变化显示,OXA (100pmol)能使各组大鼠各心功能指标(HR、 MAP、+dp/dtmax及-dp/dtmax)明显升高,并且升高幅度在AMI大鼠更明显。RVLM注射OXA抑制剂SB (100pmol)、Tempol (50nmol)或Apo (5nmol)能够阻断OXA引起的心血管效应(P<0.05或P<0.01,n=7)。(10)微透析结合HPLC结果显示,AMI大鼠单侧RVLM微量注射OXA(100pmol),注射后第一、第二及第三个10minRVLM透析液中氨基酸含量与注射前10min内的相比,EAA谷氨酸(Glu)释放增多(P<0.05, n=6), IAA甘氨酸(Gly)和牛磺酸(Tau)释放减少；预先注射Tempol (50nmol)、Apo(5nmol)后再注射OXA,与单独注射OXA相比,Glu释放明显减少(三者P<0.05,n=6),Gly与Tau稍有增加。结论：结扎大鼠冠脉左前降支可以成功制备AMI大鼠模型,其心功能明显下降,继发交感活性增强；电针内关穴可以增强AMI大鼠的心功能,降低继发的交感活性增强。这可能与中枢部位下丘脑外侧区的OXA及RVLM的OXlR表达上调有关,并且AMI大鼠RVLM的活性氧释放增多,NADPH氧化酶与OX1R在RVLM存在共表达,外源性OXA的心血管效应可以被Tempol和APO阻断,同时观察到OXA可引起AMI大鼠,RVLM区EAA-Glu增多,IAA-Gly/Tau减少,而Tempol及Apo可阻断这一效应。这都提示了针刺改善心肌缺血的机制之一是通过下调中枢OXA及OX1R,进而降低NADPH氧化酶的活性,减少ROS的产生,降低EAA升高IAA,减少交感传出,使交感活性趋于正常状态,从而保护心肌、改善心功能。