蛋白质组学研究覆盖了生命科学各领域,涉及到诸如信号转导、细胞分化、蛋白质折叠等各种重要的生物学现象。然而,蛋白质组样品复杂度高、动态范围宽,蛋白丰度变化大,尽管质谱仪器的精度和分辨率得到了大幅度提升,但由于扫描速率等自身条件限制,在对肽段混合物的分析时,也只有16%的肽段能被质谱检测到,这其中还包括了大量冗余肽段的信息。另一方面,有研究发现,对酵母样品进行重复实验9次,鉴定到的蛋白数量才能达到饱和,揭示了蛋白质组学研究中肽段鉴定的随机性和实验的可重复性差等问题。再加之,随着对生命进程研究的深入,特别是涉及脑科学的研究,很多生物样品珍贵且量少,比如人脑样、太空搭载样品等,如果进行多次重复实验,不仅耗时,更重要的是样品量满足不了实验需求。矛盾的是,在实际应用中,为了得到可靠的蛋白质组学鉴定结果,又不得不进行大量的重复实验。这就迫切的需要更有效的分析方法,对分析效率也提出了更高的要求。为解决上述问题,本研究通过优选目标肽段并结合肽段色谱保留时间的预测和校正,建立一种既能满足发现蛋白质组学研究,又能满足靶向蛋白质组学研究的新策略。新策略旨在降低质谱检测的随机性、提高质谱的检测效率和检测可靠性。新策略在方法学上重点解决三个问题:一是根据实验需求,选定目标蛋白,并由此获取目标蛋白对应的理论酶切肽段,在对理论酶切肽段的特异性、离子化效率、等电点、肽段长度和疏水性值进行预测分析的基础上,优选出目标肽段,减少高丰度肽段或者是其他非目标冗余肽段的干扰;二是对优选出的目标肽段进行色谱保留时间预测和校正,得到目标肽段保留时间相对准确的校正值;三是根据目标肽段保留时间校正值,设定质谱检测窗,提高目标肽段的检出率,改善质谱检测的可靠性和重复性。在建立新策略和新方法基础上,开展新方法在蛋白质组学的应用研究,取得以下创新性结果:1.建立了基于目标肽段理化性质分析的优选方法。利用现有的生物信息学技术和工具筛选目标肽段。首先利用Skyline对目标蛋白进行理论酶切,产生长度为8-25个氨基酸序列的肽段,用BLAST对产生的理论酶切肽段进行同源性检测,保留所有同源性为100%的肽段作为目标肽段;用GenePattern对非同源理论酶切肽段的离子化效率(ESP)进行预测,保留ESP值≥0.3的肽段;用PIPredictor分析肽段的等电点(pI),保留p I值≥4的肽段;利用SSRCalc分析肽段的疏水性值(HI),考虑3≤HI≤25的肽段。综上,优选出目标肽段。2.建立了基于标准肽段的色谱保留时间校正方法。在现有蛋白质组学数据基础上,筛选出在ESI电离条件下质谱检出率高,分布在整个液相洗脱梯度内,长度适中的15条肽段作为标准肽段。通过LC-MS/MS检测分析,得到标准肽段的色谱保留时间实验值。以标准肽段为间隔,将整个色谱洗脱梯度划分成若干区间,以这些区间内标准肽段保留时间的预测值和实验值建立建立回归曲线,并以此对目标肽段的保留时间预测值进行校正。分析结果表明:(1)四点校正模式最优,其均方根误差最小(RMSE=6.03),判定系数最高(R~2=0.81);(2)对BSA的考察结果表明,在相同的液相分离条件下,BSA目标肽段保留时间校正值和实验值误差ΔT≤2min的肽段数,占检测肽段总数的比例在常规液相分离系统中是78.95%,微流分离系统中是68.42%,在纳流分离系统中是63.16%;(3)结合生物样品的实际应用情况,在微流分离系统中,肽段色谱保留时间校正值和实验值的判定系数R~2=0.81;校正值和实验值误差ΔT≤2 min的肽段数比例为45%。校正模型回归分析的判定系数和准确度均高于ELUDE和SSRCalc预测模型。3.设计开发了基于目标蛋白驱动的优选肽段数据库。本研究设计开发了一个基于Visual Studio 2010开发平台,利用Microsoft Access 2010建立的优选肽段数据库。数据库储存内容来自所优选的目标肽段集。数据库字段涵盖了肽段序列、肽段保留时间、m/z、CE值等多方面的数据。在设计好数据库字段后,将12条字段分别建立12个独立的数据库报表。再依据表与表之间的逻辑关系,建立联系,将独立的数据表整合为一体,并在每个数据表上建立窗体,制造图形化用户界面。最后建立搜索、录入和输出等工作部件,实现数据库储存、数据导入、数据导出和查询等功能。4.开发了基于本研究建立的保留时间校正方法的校正软件。该软件实现了对目标肽段色谱保留时间的自动校正,使得校正方法得以简洁快捷的实现。软件是在Visual Studio 2010开发环境下,结合.NET技术集成。开发和设计的需求是将基于标准肽段的色谱保留时间校正方法载体化,实现一键输出目标肽段的色谱保留时间校正值。所开发的校正软件包含两大功能模块和四个子系统,分别是计算模块、结果展示与分析模块。计算模块负责执行两个任务,一个是建立标准肽段的校正曲线;另一个是对目标肽段保留时间预测值进行校正计算。而结果展示与分析模块负责输出标准肽段回归曲线和目标肽段校正曲线,并将目标肽段的保留时间校正值在软件界面列表展示。四个子系统包括信息的录入和输出系统,校正模式的选择系统,数据显示系统和操作系统。所开发的校正软件完整的实现了基于标准肽段的色谱保留时间校正算法,可以快捷准确地对目标肽段保留时间进行校正,并且易于操作,运行稳定。5.新策略新方法的实际应用。(1)在标准蛋白中的应用。结果显示,对BSA目标肽段色谱保留时间校正值和实验值进行线性回归分析,其判定系数R~2=0.94;校正值和实验值误差ΔT≤2 min的肽段数比例为62.5%;(2)建立了6-OHDA单侧损毁的PD大鼠模型,以PD通路为驱动,对PD大鼠纹状体蛋白进行研究。首先将大鼠PD通路上的理论蛋白按照所建立的目标优选方法进行优化筛选,得到大鼠PD通路蛋白的优选目标肽段库。然后用所建立的保留时间校正方法对这些目标肽段进行保留时间预测和校正,得到目标肽段的保留时间校正值。最后,选用质谱的“Preferred”采集模式,将目标肽段的离子作为优选离子进行质谱检测分析。结果显示,目标肽段的保留时间校正值和实验值的回归分析判定系数R~2=0.88;肽段保留时间校正值和实验值误差ΔT≤2min的肽段数比例高于ELUDE和SSRCalc预测模型。对肽段保留时间校正值和实验值误差ΔT≤2min的69条肽段进行6次重复实验,实现95.65%的肽段在6次重复实验中都能被检测到。在以PD通路线粒体蛋白为目标的研究中,也得到了较好的应用效果;(3)策略应用在重离子辐射大鼠模型中。先对重离子辐射大鼠皮层的蛋白质进行差异组学的分析,共鉴定到352个蛋白,其中239个蛋白表达上调。通过生物信息学分析,发现参与糖酵解过程的蛋白都表达上调,揭示辐射后,大鼠的能量代谢发生障碍,糖酵解过程的蛋白上调发挥能量代偿作用。以这些鉴定到的糖酵解通路蛋白为目标,利用新策略对鉴定到的蛋白进行重复检测验证。结果显示,目标肽段的保留时间校正值和实验值的回归分析判定系数R~2=0.79;6次重复实验中,目标肽段重复检出率为86%。综上所述,所建立的旨在改善蛋白质组学中检测可靠性的新策略和新方法能够在从简单样品体系到复杂生物样品体系中得到很好的验证和应用。一方面,新策略减少了冗余肽段对目标肽段的干扰,在目标肽段洗脱的特定时间范围内,增加质谱对目标肽段的检出率,同时也保证了质谱检测的重复性;另一方面,利用肽段理化性质和保留时间辅助鉴定蛋白信息,得到可靠的蛋白组学鉴定结果,提升了蛋白质组学检测的可靠性。