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镉是一种常见的环境和工业重金属污染物,急性或慢性的镉蓄积均能引起多种组织和器官的损伤。大脑是镉毒性作用的重要靶器官之一,现有的研究表明,镉能够通过血脑屏障,引起神经细胞凋亡。Fas/FasL信号通路是最重要的死亡受体通路之一,在细胞凋亡过程中发挥重要作用。有研究表明,Fas/FasL信号通路可以介导MAPK通路和线粒体通路引起细胞凋亡。本课题组前期研究表明,镉可以通过Fas/FasL信号通路、MAPK通路和线粒体通路引起神经细胞凋亡,但镉致神经细胞凋亡Fas/FasL信号通路与MAPK通路、线粒体通路之间的联系机制尚不清楚。本试验以神经细胞株大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞(PC12细胞)为模型,通过体外试验探究了 Fas/FasL在镉致PC12细胞凋亡中的作用以及对MAPK通路和线粒体通路的调控机制。1.慢病毒介导Fas基因沉默PC12细胞株的构建为获得Fas基因沉默PC12细胞株,本试验通过3种不同干扰靶点的Fas shRNA慢病毒感染PC12细胞12h,用含有嘌呤霉素(工作浓度为4mg/L)的完全培养液持续培养细胞48h。通过荧光显微镜观察,计数100个细胞中表达绿色荧光蛋白的细胞个数,计算慢病毒的感染效率;qRT-PCR检测Fas基因转录情况;Western-blot检测Fas蛋白表达情况。结果显示,感染复数为10时,shRNANC慢病毒和3号Fas shRNA慢病毒能够高效感染PC12细胞,感染效率可达80%;shRNANC慢病毒不影响PC12细胞Fas基因转录和蛋白表达,Fas shRNA慢病毒能够有效抑制PC12细胞Fas基因转录和蛋白表达,可分别做阴性对照组(NC组)和Fas基因沉默组(Fas shRNA组)进行后续试验。2.Fas/FasL在镉致PC12细胞凋亡中的作用为研究Fas/FasL在镉致PC12细胞凋亡中的作用,用10 μmol/L CdAc2分别处理NC组细胞和Fas shRNA组细胞12 h,或用10 μmol/L CdAc2和10 mg/L Anti-FasL单独或者联合处理PC12细胞12 h。通过Western-blot检测Fas/FasL信号通路相关蛋白Fas、FasL、FADD、Cleavedcaspase-8、Daxx和ASK1的表达;Hoechst33258染色,激光共聚焦显微镜观察细胞核形态变化;流式细胞术检测细胞凋亡率。结果显示,Fas shRNA能够极显著抑制镉引起的PC12细胞Fas/FasL信号通路相关蛋白表达量升高(P<0.01);Fas shRNA和Anti-FasL均能够减少镉引起的PC12细胞细胞核固缩、染色质致密浓染、核碎裂等细胞凋亡典型变化,极显著抑制细胞凋亡率升高(P<0.01)。说明Fas/FasL在镉致PC12细胞凋亡过程中具有重要作用。3.Fas/FasL对镉致PC12细胞凋亡MAPK通路的调控作用为研究Fas/FasL对镉致PC12细胞凋亡MAPK通路的调控作用,用10μmol/L CdAc2分别处理NC组细胞和Fas shRNA组细胞12 h,或用10 μmol/L CdAc2和40 pmol/L Z-IETD-FMK(caspase-8特异性抑制剂)单独或联合处理PC12细胞12 h。通过Western-blot检测MAPK通路相关蛋白ERK1/2、JNK1/2的表达及其磷酸化水平。结果显示,Fas shRNA和Z-IETD-FMK均能够极显著抑制镉引起的PC12细胞ERK1/2和JNK1/2磷酸化水平的升高(P<0.01)。说明Fas/FasL调控MAPK通路参与镉诱导的PC12细胞凋亡。4.Fas/FasL对镉致PC12细胞凋亡线粒体通路的调控作用为研究Fas/FasL对镉致PC12细胞凋亡线粒体通路的调控作用,用10 μmol/LCdAc2分别处理NC组细胞和Fas shRNA组细胞12 h,或用10 μmol/L CdAc2和10 mg/L Anti-FasL单独或联合处理PC12细胞12 h。通过Western-blot检测线粒体通路相关蛋白Bax、Bcl-2、AIF 和 Endo G 的表达,Cyt C 的释放,BID、caspase-9、caspase-3 和 PARP 的活化水平;流式细胞术检测线粒体膜电位变化;免疫荧光法检测AIF核转位情况。结果显示,Fas shRNA能够显著或极显著抑制镉引起的PC12细胞tBID/BID和Bax/Bcl-2比值升高,线粒体内 Cyt C 释放,caspase-9、caspase-3 和 PARP 活化,AIF 和 Endo G 表达量升高(P<0.05或P<0.01),并抑制AIF核转位;Anti-FasL能够极显著抑制镉引起的PC12细胞tBID/BID和Bax/Bcl-2比值升高,线粒体膜电位降低(P<0.01)。说明Fas/FasL调控线粒体通路参与镉诱导的PC12细胞凋亡。结论:Fas/FasL在镉致PC12细胞凋亡过程中具有重要作用,Fas shRNA和Anti-FasL均能够极显著抑制镉引起的PC12细胞凋亡率的升高;同时Fas/FasL还能够调控MAPK通路和线粒体通路参与镉致PC12细胞凋亡。