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目前已知一百多种转录后修饰会影响真核生物RNA命运,并进一步影响转录产物功能、定位、稳定性等等,与人类多种疾病息息相关。现在知道广泛存在修饰的RNA包括rRNAs、tRNAs、snRNA、miRNA等各种非编码RNA和mRNA等。另外,古细菌、细菌和真核生物一样,也普遍存在mRNA修饰。真核生物中,编码RNA和非编码RNA的3’末端不依赖模板添加核苷酸是一种重要的转录后修饰,根据添加核苷酸种类的不同分为腺苷酸化,尿苷酸化,胞苷酸化和鸟苷酸化四种。最常见的腺苷酸化的主要功能是导致RNA降解和起始翻译,而胞苷酸化和鸟苷酸化至今研究较少,对尿苷酸化的研究近几年则取得突破性进展。RNA 3’端无模板地添加尿苷酸,我们称为尿苷酸化修饰,有助于调节基因表达,例如触发RNA降解,促进RNA加工或保持RNA稳定性。帮助完成尿苷酸化修饰的酶称为末端尿苷酸转移酶(TUTases),属于DNA聚合酶β超家族,通常由DNA聚合酶β核苷酸转移酶结构域(NTD)和poly(A)聚合酶相关结构域(PAP)共同构成。NTD位于蛋白质N端,包含三个保守的天冬氨酸(Asp)或谷氨酸(Glu)螯合二价金属离子以完成催化,因而我们又可以将其称为催化结构域(CAT domain);PAP内有一段保守的、无序的Ⅱ型核苷酸识别区域(NRM),其中的组氨酸(His)参与UTP识别,PAP又可称为中心结构域(CD domain)。从低等到高等生物中,转移酶结构也趋于复杂,除了 NTD和PAP外,还进化出锌指等多种结构域促进蛋白质-蛋白质相互作用和蛋白质-RNA相结合。拟南芥中,HEN1 SUPRESSOR 1(HESO1)最先被确定为对大多数去甲基化的miRNA进行尿苷酸修饰的核苷酸转移酶,随后有研究发现HESO1缺失时有另一转移酶 UTP:RNA URIDYLYLTRANSFERASE 1(URT1)会对 miRNA 进行尿苷酸化修饰,URT1作为拟南芥第二大尿苷酸转移酶可以与HESO1一起为不同形式RNA底物添加尿苷酸尾巴。在体外实验中,二者偏好具有不同类型3’末端核苷酸的miRNA底物(HESO1偏好3’U,而URT1偏好3’A);在体内实验中,它们可作用于同一 miRNA的不同大小的突变体,并且发现,URT1和HESO1会协同有序地作用于某些miRNA,即URT1先单尿苷酸化修饰miRNA,然后再由HESO1对其进行进一步的尿苷酸化。此外,并不是仅有URT1被报道对底物RNA3’末端核苷酸具有偏好性,2018年我们课题组在NAR上报道了果蝇中尿苷酸转移酶Tailor是如何选择性催化3’端为G的RNA底物的尿苷酸化修饰。为进一步研究URT1/HESO1调控拟南芥RNA代谢的分子机制,我们首先解析出URT1单体、URT1-UTP和URT1-AAAU复合物晶体结构,这一系列结构是目前为止首次在植物物种中报道尿苷酸转移酶的结构。结合体外功能研究和序列比对分析,我们发现URT1在进化上比较保守,与裂殖酵母Cid1具有相似的UTP识别机制,即主要依赖丝氨酸(Ser)和赖氨酸(Lys)与UTP直接氢键结合,利用酪氨酸(Tyr)π-π堆积稳定UTP,以及利用H714对UTP进行选择识别。Tailor中R327和N347是导致偏好3’G的两个关键氨基酸,并且突变后大大降低酶活效率,而URT1中对应的R531和N552突变后对酶活效率影响相对较小,我们猜测URT1对底物RNA的偏好性机制可能与Tailor并不相同,需要进一步的研究来找到影响URT1偏好性的关键氨基酸。最后,URT1结合RNA后,整体结构发生变化,催化结构域向中心结构域靠拢,R531发生大幅度偏转并与D700形成氢键相互作用,这一现象在同源蛋白质中目前并未发现。