类弹性蛋白在抗菌肽分离纯化中的应用

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抗生素的发现使人们对由病原微生物感染而引发的各类疾病不再束手无策,在过去的半个多世纪,对人类健康作出了巨大贡献。但随着“传统抗生素”的广泛使用,同时也产生了很多问题,如B-内酰胺类抗生素的过敏反应以及长期使用导致抗药菌株的产生。抗菌肽(Antimicrobial polypeptides,AMPs)是两性带电分子,广泛存在于多种生物体内,具有广谱抗菌、调节免疫、抑制肿瘤等多种生物学功能,实践表明抗菌肽不仅对耐药性的病原细菌有很好的抑制和杀灭作用,而且还对真菌、原生动物、病毒等有很好的抑制作用,另外某些抗菌肽还可选择性杀伤肿瘤细胞,抑制HBV、HIV的复制,因而引起了科学家的很大的关注,被认为是最有可能替代抗生素的新一代广谱抗菌药物。但是由于抗菌肽本身的抗菌活性和分子量等原因,目前尚未无成熟的表达纯化策略,因此本文的研究目的是利用类弹性蛋白的独特性质来融合表达和纯化抗菌肽,以期获得表达量大且易于达到高纯度的抗菌肽。研究主要从以下两个方面来开展:一,选用大肠杆菌偏爱密码子,根据GenBank中的基因序列,利用PCR反扩载体的方法在pFastBac质粒多克隆位点引入抗菌肽Halocidin18(Hal18)基因,然后与类弹性蛋白(elastin-likepolypeptides,Elps)融合,构建重组表达质粒pET23a-Hal-9Elp。将重组质粒转化大肠杆菌,表达融合蛋白H9E,实验结果表明,融合蛋白得到表达(69mg/L),同时利用类弹性的性质对融合蛋白进行纯化,融合蛋白的纯度达到95%,利用羟氨将抗菌肽从融合蛋白上释放出来,纯化后得到1.7ml/L纯度为70%左右的Hal18,管叠法测定抗菌肽抑菌活性,结果显示出很强的抑制藤黄八叠球菌和大肠杆菌的活性;类弹性蛋白作为融合伴侣在大肠杆菌中成功表达和纯化抗菌肽,较其他融合伴侣在表达和纯化抗菌肽方面具有表达量大,纯度高,易于大规模放大的优势。二,将抗菌肽类弹性蛋白基因,克隆至毕赤酵母分泌表达载体pHBM905,连接后转化毕赤酵母GS115,在甲醇氧化酶(AOX)启动子调控下,融合蛋白得以表达,目的蛋白分子量大小与理论大小一致,通过初步筛选,得到一株产融合蛋白448.5mg/L的重组酵母菌,纯化后的抗菌肽显示出了很好的抑制酵母的活性,在酵母中的成功表达,在提高目的蛋白表达量的同时也为以后表达抗真菌抗菌肽提供了很好的理论依据。
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