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原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)简称肝癌,发病率和死亡率都很高恶性肿瘤之一,传统抗癌药物普遍存在药效短、见效慢、需要多次给药的问题,而基因治疗带来了新希望。重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体因其具有在体内外长期高效表达、免疫原性低等优点,被广泛应用于临床试验并取得了良好疗效。此外,与研究较深入的单链AAV2相比,AAV8具有免疫原性低、肝脏靶向性强的优势,自身互补型AAV(self-complementary AAV,scAAV)具有高效快速表达的特点,因而scrAAV8被认为是肝脏相关疾病基因治疗最具前景的载体。Kallistatin(KAL),一种内源性血管生成抑制因子,不仅能抑制血管生成、血管舒张,还具有显著的抗氧化、抗炎症及抗肿瘤的多重功效。研究表明,ssrAAV2-KAL可显著抑制肝癌的增殖,本研究以scrAAV2-KAL做比较,探讨scrAAV8-KAL在体内外对肝癌治疗作用,寻求一种更安全有效、靶向性更强的肝癌治疗基因药物,为临床应用提供依据。scrAAV-KAL抗肿瘤、抗氧化应激和抗血管生成作用分三部分进行如下研究:本研究首先选取易于定量检测的Gaussia luciferase(Gluc)作为报告基因,制备两种参比scrAAV2/8-Gluc,同时生产自身互补型scrAAV2/8/9-KAL和单链ssrAAV8-KAL四种基因药物,以HUVEC、人源肝(癌)细胞为研究对象,对rAAV的转导效率进行筛选。Elisa检测转染后细胞上清中KAL的表达,scrAAV8在肝癌细胞中高表达,与scrAAV8相比,scrAAV9在多数细胞内转导效率低,ssrAAV转导效率较高,scrAAV2在HUVEC、肝正常细胞高表达;体外检测基因药物对HUVEC、肝(癌)细胞增殖、周期的影响,结果表明其对肝正常细胞没有明显影响,但是提高Hep G2肝癌细胞S期比例,明显抑制HUVEC/SMMC-7721细胞活力,将细胞周期阻滞在G0/G1期;划痕法、Western Blot和小管形成实验结果显示:scrAAV8组可以明显抑制SMMC-7721迁移、上皮间质转化,四种药物均能抑制HUVEC小管形成能力;基因药物预处理可以提高氧化应激损伤后HUVEC、HepG2细胞活力、ROS水平和超氧化物岐化酶SOD、谷胱甘肽还原酶GSH-px活性、总抗氧化能力,抑制乳酸脱氢酶LDH释放;本研究最后进行体内药效学实验,不同免疫背景小鼠(Balb/c、C57BL/6)体内以不同血清型、剂量、给药途径给药,36周后血清中KAL依然高表达,scrAAV8尾静脉注射组的血清以及肝脏内kal表达量最高。基因药物对HepG2肝癌皮下移植瘤的增殖、侵袭具有抑制作用,scrAAV8-Kal作用大于scrAAV2-Kal。基因药物可以选择性杀伤HUVEC、肿瘤细胞,抑制其增殖、迁移,对肝正常细胞没有显著作用,并通过抗氧化应激作用保护细胞,scrAAV2-KAL对HUVEC作用明显,scrAAV8-KAL对肝癌细胞作用更为显著;体内scrAAV8-KAL对肝脏转导效率更高,能更有效地抑制肝癌的增殖、侵袭。综上所述,本研究结果为肝癌的临床前研究提供了有力的实验支持,而且scrAAV8-KAL是一种前景看好的临床试验基因候选药物。