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目的退热解毒灵是一种抗呼吸道病毒复方中药制剂。本实验旨在研究退热解毒灵体内外抗流感病毒(Flu virus, Flu)的活性及作用方式。并进一步观察退热解毒灵对小鼠流感病毒肺炎的药效及其免疫学机制,为临床广泛应用提供实验依据。方法1.在体外实验中,根据病毒感染细胞的过程,设立药物直接灭活病毒、药物抑制病毒感染和药物对病毒穿入细胞后的抑制这三种作用方式。在微量细胞培养板上,通过观察细胞病变效应、噻唑兰比色法和空斑减数试验来检测细胞存活率和病毒抑制率；通过病毒滴定检测病毒滴度的变化。实验设立药物病毒唑与抗病毒口服液对照组。2.在体内实验中,以BALB/c小鼠经鼻吸入流感病毒鼠适应株A/FM/1/47(H1N1),建立小鼠病毒性肺炎模型,并用退热解毒灵进行治疗,设立药物病毒唑与抗病毒口服液对照组。在病毒感染后第14天,观察小鼠体重变化和存活情况,计算生存率。同时,摘取感染小鼠肺脏,称重,计算肺指数,用微量血凝法测定肺组织匀浆中病毒血凝滴度；记录肺脏大体病变程度,肺脏福尔马林固定,石蜡包埋,常规切片,HE染色,光镜下观察其组织病理学改变。制备脾细胞悬液,MTT法检测T淋巴细胞增殖情况,生物活性法检测T淋巴细胞分泌IL-2和IFN-γ的能力。应用流式细胞仪,检测小鼠静脉血T淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+百分比及CD4/CD8比例。实时荧光定量PCR和Western-blot法检测肺组织中细胞因子TNF-α、IL-1β、MCP-1、IL-10的基因表达。采用双抗体夹心法,检测小鼠血清中细胞因子TNF-α、IL-6、IL-4、IL-10、IL-2和IFN-γ含量。结果1.体外实验：(1)退热解毒灵直接灭活Flu各组中,随着药物浓度的增加,感染Flu细胞的CPE逐渐减轻、病毒的抑制率增加。当药物浓度为160μg/mL时,病毒抑制率为85.2%。空斑减数率为80.1%。退热解毒灵对Flu的半数有效浓度IC50为10.2μg/mL；治疗指数TI为9.7,优于阳性对照抗病毒口服液(P<0.05)。(2)退热解毒灵抑制Flu感染各组中,预先处理2h组的细胞均呈现典型的CPE表现,MTT结果显示各感染组的病毒抑制率与病毒对照组比较无显著差异；8h后退热解毒灵浓度的增高,病毒的滴度降低、病毒抑制率增大。当药物浓度为160μg/mL时,病毒抑制率为84.3%,空斑减数率为79.3%,对Flu的半数有效浓度IC50为11.9μg/mL,治疗指数TI为10.7,优于阳性对照抗病毒口服液(P<0.05)。(3)退热解毒灵对Flu穿入细胞后的抑制作用组中,随着药物浓度的增加,感染Flu细胞的CPE逐渐减轻、病毒的抑制率增加。当药物浓度为160μg/mL时,病毒抑制率为84.2%,空斑减数率为78.2%,对Flu的半数有效浓度IC50分别为11.1μg/mL、治疗指数T1分别为10.3,优于阳性对照抗病毒口服液(P<0.05)。2、体内实验：(1)退热解毒灵高低剂量组与病毒对照组比较,生存率明显升高,体重下降得到改善,血凝滴度和肺指数都显著降低。(2)病理学结果表明：经退热解毒灵治疗后,各药物组与病毒对照组相比,肺脏病理学改变有明显的改善。(3)与正常对照组比较,病毒对照组小鼠脾T淋巴细胞增殖能力降低(P<0.05),分泌IL-2和IFN-γ的能力下降(P<0.05)；与病毒对照组比较,退热解毒灵治疗后T淋巴细胞增殖能力和分泌IL-2和IFN-γ能力,均显著提高(P<0.05)。(4)与正常对照组和病毒对照组比较,退热解毒灵治疗各组CD3+、CD4+的百分比,明显提高(P<0.05),CD8+在退热解毒灵中剂量治疗组和病毒唑组是最高,但在高剂量组偏低。退热解毒灵高剂量组CD4/CD8比值相对其它各组最高。(5)与正常对照组比较,病毒对照组肺组织中细胞因子TNF-α、IL-1β、MCP-1、IL-10的基因表达,明显增强(P<0.05)；与病毒对照组比较,退热解毒灵治疗各组肺组织中MCP-1、TNF-α、IL-1p表达显著减少(P<0.05)；而IL-10表达则增多(P<0.05)。(6)退热解毒灵治疗各组与病毒对照组比较,小鼠血清中TNF-α、IL-6明显降低(P<0.05),IL-4水平显著减少(P<0.01),IL-10、IL-2和IFN-γ显著升高(P<0.01,p<0.05)。结论1.退热解毒灵对Flu具有较强的直接灭活作用,能明显的抑制Flu在Hep-2细胞内复制增殖。退热解毒灵对Flu的直接灭活作用和抑制Flu感染细胞的作用强于阳性对照抗病毒口服液(P<0.05)。2.退热解毒灵对小鼠流感病毒性肺炎有较好的治疗作用,其可能的免疫学机制：1)抑制病毒在肺部的增殖的同时,减轻了病毒对肺组织的直接损伤。2)通过促进T淋巴细胞的分泌,提高T淋巴细胞增殖能力,进而提高细胞免疫应答水平,增强抗病毒能力。3)其免疫调节机制与下调MCP-1、TNF-α、IL-6、IL-1p的表达,上调IL-10、IFN-γ、IL-2的表达有关。