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目前,乳品安全事件频发,这其中相当一部分是由于乳中致病菌污染所引起的。而金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌又是牛乳中引起人中毒的主要致病菌。因此,针对这3种细菌及其毒素的快速检测方法和技术一直是研究的热点。其中,PCR技术因具有高度的特异性、高效性及灵敏性而被广泛应用。本实验从牛乳中分离出金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和产气荚膜梭菌菌株,然后对金黄色葡萄球菌（ATCC25923）的nuc基因、大肠杆菌（ATCC25922） 16S-23S rRNA基因和产气荚膜梭菌（ATCC13124）cpa基因进行PCR扩增,同时也对从乳中分离的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌和沙门氏菌等菌株进行PCR扩增,通过是否扩增出目的条带来验证nuc、16S-23S rRNA和cpa这3种基因分别在检测金黄色葡萄菌、大肠杆菌和产气荚膜梭菌时是否具有特异性。最后,对PCR扩增产物进行测序,再将测序结果分别与Genbeank中V01281;CU928160.2和L43546.1标准序列进行比对,三者的同源性都达到99.50%以上,证明这3对引物有很好的特异性。在试验中,通过不断优化影响多重PCR反应的各种因素,最终确定了本实验最佳反应条件为:Mg2+ （25 mmol ） 1.5μL;引物浓度分别为金黄色葡萄球菌和产气荚膜梭菌80 nmol/L,大肠杆菌40 nmol/L; dNTP（2.5 mmol） 2μL;Taq DNA聚合酶（2.5 U） 0.5μL。循环参数为:94℃预变性7 min;94℃变性30 s;55℃退火30 s;71℃延伸1 min 30 s;71℃延长延伸5 min;30个循环次数。在最佳实验条件下,3种细菌检测的灵敏性都达到了l0 cfu/mL;本实验对人工污染的巴氏乳进行了应用性检测,当上述3种细菌在牛乳中含量达102cfu/mL,本实验建立的检测方法可以在6 h内检测出。通过多重PCR扩增,验证了nuc、16S-23S rRNA、cpa 3种基因分别在检测牛乳中金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和产气荚膜梭菌实验中的特异性,通过不断优化各种反应条件来提高PCR检测的灵敏性和准确性。通过对市售牛乳样品的应用性检测,证明将nuc、16S-23S rRNA、cpa作为靶基因的多重PCR检测方法,在检测牛乳中金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和产气荚膜梭菌时的可行性。